胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Ezrin、C14orf166的相互作用蛋白的篩選及C14orf166對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Ezrin、C14f166的相互作用蛋白的篩選及C14f166對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響姓名：張登祿申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)指導(dǎo)教師：韓金祥20100428山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章Ezrin、C140rfl66真核表達載體的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞的表達目的：構(gòu)建含有Ezrin、C140rfl66基因的真核表達載體，并使其在293T細(xì)胞中表達方法：提取人胰腺癌Panc

2、i細(xì)胞總RNA，RTPCR法擴增Ezrin、C140rfl66基因。將擴增得到的基因片段，利用PCR引入酶切位點和標(biāo)簽，與pcDNA31質(zhì)粒連接，獲得pcDNA31Falg—Ezrin—His和pcDNA3卜Flag—C140rfl66一His重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化EcohDH5Q，雙酶切后測序鑒定。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后，利用RTPCR和Western—bolt驗證外源基因的表達情況結(jié)果：RTPCR擴增出的基因片段與理

3、論DNA表達片段大小一致，測序鑒定顯示克隆的基因序列與GenBank報道序列相符。RTPCR、Western—blot證明外源基因在293T細(xì)胞中成功表達。結(jié)論：成功構(gòu)建了表達載體pcDNA3卜Flag—Ezrin—His、pcDNh3卜Flag—C140rfl66His，在293T細(xì)胞中成功表達。關(guān)鍵詞：Ezrin；C140rfl66：真核表達；轉(zhuǎn)染第二章Pulldorn結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)Ezrin、C140rfl66相互作用蛋白

4、目的：篩選人胰腺癌細(xì)胞中與Ezrin、C140rfl66蛋白相互作用的蛋白。方法：利用脂質(zhì)體將真核表達載體pcDNA31一Flag—C140rfl66His、pcDNA31FlagEzrinHis轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。采用Ni—agrose進行His標(biāo)簽蛋白的pulldown純化，分離Ezfin、C140rfl66的蛋白結(jié)合復(fù)合體，對蛋白混合物進行SDSPAGE分析，選擇差異條帶，進行LC／MS／MS或MALDITOFTOF質(zhì)譜鑒定。結(jié)果