羅哌卡因乳酸羥基乙酸共聚物微球在小鼠的體內(nèi)評(píng)價(jià).pdf

1、研究背景和目的: 盡管目前國(guó)內(nèi)外在基礎(chǔ)及臨床的科學(xué)研究中都取得很大進(jìn)步，但在疼痛治療方面仍有較大挑戰(zhàn)。局麻藥及其化合物在不同階段承擔(dān)著減輕或消除疼痛的角色，局部應(yīng)用局麻藥進(jìn)行術(shù)后鎮(zhèn)痛是一種最直接有效的方法。局麻藥可以通過(guò)暫時(shí)可逆阻斷局部神經(jīng)傳導(dǎo)達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。但臨床上所應(yīng)用的水溶性局麻藥不可能通過(guò)單次注射達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間的術(shù)后鎮(zhèn)痛及癌性疼痛等長(zhǎng)時(shí)間鎮(zhèn)痛要求。目前時(shí)效最長(zhǎng)的水溶性局麻藥一次給藥后的鎮(zhèn)痛時(shí)間不超過(guò)12小時(shí)。臨床上通常采用間斷

2、注射局麻藥或通過(guò)體內(nèi)導(dǎo)管植入持續(xù)給藥等方式達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間的鎮(zhèn)痛要求，但卻需要比較昂貴的設(shè)備及連續(xù)監(jiān)護(hù)，且給藥累積過(guò)多可導(dǎo)致呼吸及循環(huán)的抑制，并產(chǎn)生局麻藥中毒；長(zhǎng)時(shí)間留置導(dǎo)管容易引起感染或?qū)Ч芤莆患按蛘?，所以這些方法并不是解決長(zhǎng)時(shí)間鎮(zhèn)痛問(wèn)題的最好途徑，因而需要探索出一種更優(yōu)化的方法。近三十多年來(lái)，乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）緩釋微球給藥系統(tǒng)是藥劑學(xué)研究的熱點(diǎn)。隨著藥物緩釋技術(shù)的發(fā)展，長(zhǎng)時(shí)效局麻藥緩釋微球的制備已成為可能，將局部麻醉藥合成可控

3、制性釋放的制劑，通過(guò)單次給藥即能達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間鎮(zhèn)痛的要求，從而減少給藥次數(shù)，而且由于其緩慢而穩(wěn)定的釋放，使其血藥濃度低且波動(dòng)小，大大降低了局部麻醉藥的毒性。 PLGA是一種生物可降解的合成高分子材料，由于其易合成、質(zhì)量穩(wěn)定、生物相容性好、生物降解可控性及其降解產(chǎn)物毒性低等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究最多的可生物降解材料之一，其中間產(chǎn)物為乳酸，最終產(chǎn)物是水和二氧化碳，故無(wú)毒、無(wú)刺激并具有良好的生物相容性。近十多年來(lái)被廣泛應(yīng)用于微球控釋系統(tǒng)的骨架

4、材料，特別在微球埋植領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，部分藥品制劑已獲FDA批準(zhǔn)并應(yīng)用于臨床。PLGA在一個(gè)月左右即可完全降解，特別適用于局麻藥這類(lèi)半衰期短，在鎮(zhèn)痛方面又要求長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用的藥物，進(jìn)行緩釋系統(tǒng)的合成。國(guó)外有大量關(guān)于將PLGA應(yīng)用于利多卡因及布比卡因緩釋微球合成的研究報(bào)告，并發(fā)現(xiàn)均可達(dá)到緩釋及延長(zhǎng)鎮(zhèn)痛時(shí)間的作用，但至今仍無(wú)關(guān)于將其應(yīng)用于羅哌卡因緩釋方面的研究報(bào)道。 鹽酸羅哌卡因（Ropivacaine，Rop）是一種新型局部麻醉藥，對(duì)

5、中樞神經(jīng)及心血管的潛在毒性低，更安全；感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)阻滯分離程度高，被廣泛應(yīng)用于術(shù)后鎮(zhèn)痛、無(wú)痛分娩等。前期研究發(fā)現(xiàn)可成功合成羅哌卡因乳酸羥基乙酸共聚物微球（Rop-PLGA-MS），并在體外釋放實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其可緩慢釋放，一周內(nèi)可穩(wěn)定釋放80%羅哌卡因。然而只有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)才是檢驗(yàn)制劑安全、可靠的方法。本研究主要通過(guò)Rop-PLGA-MS在小鼠的體內(nèi)釋放、藥效學(xué)及生物相容性三方面對(duì)Rop-PLGA-MS進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)，從而論證Rop-PLGA-MS的

6、研究?jī)r(jià)值。 方法： 1.Rop-PLGA-MS的體內(nèi)釋放研究：昆明小鼠60只，體質(zhì)量為20-22g。按前期研究方法制備Rop-PLGA-MS，并稱(chēng)取50mg65份，隨機(jī)取5份作為對(duì)照組即0h組，其余分別埋植在60只小鼠皮下，按設(shè)定的時(shí)間間隔點(diǎn)（即植藥后1、2、3、6、12、24、48、72、96、120、144、168h）隨機(jī)分為12組，n=5。并在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死相應(yīng)組小鼠，完整取出植入的Rop-PLGA-MS烘干后連

7、同0h組微球，分別加入2ml乙腈，經(jīng)過(guò)CL-2型恒溫磁力攪拌器（37度，40rpm）攪拌12小時(shí)→超聲溶解30s→取出50ul加入1ml甲醇中→蝸旋、離心5min→提取上清液等處理，所得樣品液均采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算羅哌卡因剩余量及累積釋藥率（Q，%）。 2.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究：昆明小鼠165只，體質(zhì)量為20-22g，隨機(jī)分成A、B、C三組（N=55），給藥側(cè)坐骨神經(jīng)旁

8、分別植入Rop-PLGA-MS、羅哌卡因PLGA空白微球混合物（Rop/PLGA-MS）及注射0.5%Rop（25mg/Kg）；對(duì)照側(cè)均植入PLGA空白微球（PLGA-MS），建立動(dòng)物模型（每側(cè)植藥量均為400mg/Kg，給藥側(cè)均含等劑量羅哌卡因?yàn)?5mg/Kg）。各組內(nèi)小鼠隨機(jī)均分為11個(gè)亞組（n=5），分布于給藥后5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、10h、18h、30h、48h11個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用熱踏板法及4-

9、point scale評(píng)分測(cè)定坐骨神經(jīng)阻滯時(shí)效；并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行小鼠眼眶采血0.5ml，給予高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定血漿中Rop濃度。 3.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的生物相容性研究：昆明小鼠10只，體質(zhì)量20-22g，隨機(jī)均分為A、B兩組，A組小鼠一側(cè)下肢手術(shù)切開(kāi)暴露坐骨神經(jīng)，神經(jīng)周?chē)⑷肷睇}水0.1ml后縫合；B組小鼠手術(shù)切開(kāi)暴露坐骨神經(jīng)，其周?chē)鶆蛑踩隦op-PLGA-MS（400mg/Kg）后縫合。以A組小

10、鼠為對(duì)照研究，采用小鼠手術(shù)切口的紅腫、滲出情況以及愈合時(shí)間（拆線(xiàn)后傷口處不再裂開(kāi)，且無(wú)滲出）為指標(biāo)考察兩組小鼠手術(shù)切口愈合情況；一周后比較兩組小鼠體質(zhì)量考察Rop-PLGA-MS對(duì)小鼠發(fā)育情況的影響；兩周后處死小鼠，比較兩組小鼠局部組織及全身主要臟器的病理學(xué)改變。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及圖表均用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)參數(shù)分別采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)、One-Way ANOVA和Wilcoxon mean rank te

11、st，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果: 1.Rop-PLGA-MS的體內(nèi)釋放結(jié)果：Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)具有明顯的緩釋作用，第1小時(shí)內(nèi)可見(jiàn)明顯的突釋效應(yīng)，大部分Rop在3-48h期間穩(wěn)定釋放。6-24h是Rop-PLGA-MS釋放Rop的高峰時(shí)段，48小時(shí)內(nèi)釋放藥物達(dá)66.74±4.33%，48小時(shí)后藥物釋放趨于平緩，釋藥量較少，168小時(shí)內(nèi)釋放藥物91.83±1.31%。比較體內(nèi)釋放數(shù)學(xué)模型擬合中，以We

12、ibull分布函數(shù)擬合度最高，提示微球在體內(nèi)釋放明顯延遲，估計(jì)半衰期T1/2為42.26 h。經(jīng)Ritger-Peppas數(shù)學(xué)模型擬合表明其釋藥機(jī)制為藥物直接擴(kuò)散+藥物基質(zhì)溶蝕的協(xié)同作用。 2.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究結(jié)果 神經(jīng)阻滯結(jié)果：（1）感覺(jué)阻滯結(jié)果：A組小鼠在Rop-PLGA-MS坐骨神經(jīng)旁植入后3h，給藥側(cè)肢體開(kāi)始出現(xiàn)明顯的感覺(jué)阻滯效果，較對(duì)照側(cè)肢體的熱疼痛反應(yīng)明顯遲鈍，10-18h達(dá)到阻滯

13、的高峰，P=0.000；48h后藥效消退，P>0.05。B、C兩組小鼠給藥側(cè)5min至2h對(duì)熱踏板基本無(wú)反應(yīng)（踏板撤腿潛伏時(shí)間多超過(guò)30s）P=0.000，4h后痛覺(jué)反應(yīng)恢復(fù)正常；各小鼠對(duì)照側(cè)肢體均無(wú)感覺(jué)阻滯效應(yīng)。（2）運(yùn)動(dòng)阻滯結(jié)果：小鼠對(duì)照側(cè)肢體均無(wú)運(yùn)動(dòng)阻滯現(xiàn)象；A組小鼠給藥側(cè)肢體3h時(shí)，80%運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為2分，20%為1分（P=0.151）；4h-18h可見(jiàn)輕微的運(yùn)動(dòng)阻滯（P<0.05）；30h時(shí)運(yùn)動(dòng)阻滯開(kāi)始恢復(fù)（P=0.05），

14、48h基本恢復(fù)正常，各時(shí)間點(diǎn)各小鼠行走及步態(tài)均未見(jiàn)明顯異常。B組及C組小鼠給藥側(cè)肢體于5min-2h有較明顯的運(yùn)動(dòng)阻滯效應(yīng)，小鼠給藥側(cè)肢體出現(xiàn)拖腿現(xiàn)象；3h時(shí)80%運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為2分，20%為1分（P=0.317），運(yùn)動(dòng)阻滯無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 血藥濃度測(cè)定結(jié)果：A組小鼠3h起血漿中可測(cè)及微量Rop，10h至18h緩慢達(dá)到相對(duì)峰值（Cmax），為129.80±22.59ng/ml和120.20±23.35ng/ml，其后緩慢而平穩(wěn)地下

15、降，藥物留置時(shí)間近30小時(shí)。B、C兩組在5min時(shí)血漿即可測(cè)及較高濃度Rop，30min快速達(dá)到Cmax為1559.00±253.39ng/ml和1470.80±113.77ng/ml，其后快速下降，藥物留置時(shí)間小于4小時(shí)。 3.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)的生物相容性研究結(jié)果：兩組小鼠局部手術(shù)切口均未見(jiàn)紅腫反應(yīng)及明顯滲出；一周內(nèi)發(fā)育情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；兩周后病理切片所見(jiàn)，各小鼠心、腦、肺、肝、胰、脾均未見(jiàn)明顯組織結(jié)構(gòu)異常及各

16、種病理學(xué)改變；Rop-PLGA-MS植入側(cè)周?chē)∪饨Y(jié)締組織僅見(jiàn)輕微炎癥反應(yīng)，未見(jiàn)感染、組織細(xì)胞壞死及組織纖維化等反應(yīng)，組織結(jié)構(gòu)完整，周?chē)梢?jiàn)部分巨噬細(xì)胞吞噬，對(duì)照組小鼠局部組織也可見(jiàn)輕度炎癥反應(yīng)，但周?chē)匆?jiàn)巨噬細(xì)胞吞噬。 結(jié)論: 我們對(duì)Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)進(jìn)行釋放、藥效及生物相容性的考察得出以下結(jié)論： 1.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)具有緩慢而穩(wěn)定地釋放，其釋放特點(diǎn)可分三階段說(shuō)明：①0-3h時(shí)間段

17、藥物有一定量的釋放，第一小時(shí)釋放速率最快，是微球突釋的時(shí)間段；②3-48h時(shí)間段藥物大量釋放，是微球釋藥的擴(kuò)散+微球溶蝕釋藥階段；③48-168h時(shí)間段藥物釋放極為緩慢穩(wěn)定一般為微球基質(zhì)溶蝕釋藥階段。 2.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)可有效延長(zhǎng)Rop時(shí)效達(dá)10倍以上；血藥濃度低，Cmax為Rop和Rop/PLGA-MS給藥組的1/10以下；藥物生物利用度增加，毒性小。 3.Rop-PLGA-MS在小鼠體內(nèi)具有較好的組