乏氧對人牙周韌帶成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達的影響.pdf

1、目的:
　　 結(jié)合上皮的根方遷移以及牙周韌帶膠原纖維的降解導致牙周袋的形成是慢性牙周炎形成的主要特征之一。近年研究表明，在病理狀態(tài)下，細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)中的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinaseMMPs)合成分泌增加，活性增強，導致牙周韌帶、牙槽骨內(nèi)的膠原纖維降解。因此，MMPs在牙周病的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。牙周炎、合創(chuàng)傷與吸煙都可以造成局部牙周組織的乏氧。乏

2、氧環(huán)境對組織細胞有著重要的生物學影響，那么，乏氧是否影響該細胞對在牙周病時牙周組織破壞密切相關(guān)的MMPs/TIMPs的分泌從而在牙周病的病程中發(fā)揮重要作用，目前尚不清楚。因此本實驗旨在乏氧環(huán)境下培養(yǎng)牙周膜細胞，模擬相當于牙周膜組織局部缺血的病理模型，探討乏氧對牙周韌帶成纖維細胞MMPsmRNA表達的影響，這將對缺氧狀態(tài)下的牙周炎病理發(fā)病過程以及治療方法的選擇具有重要意義。
　　 方法:
　　 1.人牙周韌帶成纖維細胞的分

3、離培養(yǎng)及鑒定
　　 選取山東大學口腔醫(yī)院口腔頜面外科門診就診的10～20患者，向患者及家屬說明用途并征得同意后，搜集無齲壞、牙周組織健康的前磨牙，牙根已發(fā)育完成。牙齒拔除后立即放入含有雙抗的D-Hank液中保存。轉(zhuǎn)運到事先消毒好的超凈臺內(nèi)，經(jīng)瓶內(nèi)牙齒用含有雙抗的D-Hank液充分沖洗三次，無菌條件下用手術(shù)刀刮取牙根中下部分的牙周膜組織，采用組織塊法進行人牙周韌帶細胞的原代培養(yǎng)，細胞增殖達培養(yǎng)瓶面積的90％后細胞傳代，第3代細胞用

4、于細胞來源鑒定，第5代細胞用于實驗。ABC法免疫組化染色鑒定人牙周韌帶成纖維細胞的來源。
　　 2.實驗分組常氧組（對照組）:人牙周韌帶成纖維細胞在20％O2、5％CO2、75％N2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng);乏氧組:牙周膜細胞分三組在1％O2、5％CO2、94％N2的37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h，24h和48h。
　　 3.RT-PCR檢測人牙周韌帶成纖維細胞MMPs和TIMPs的表達
　　 將生長狀況良好的第5代細

5、胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在乏氧和常氧條件下培養(yǎng)。在12h，24h，48h各取一塊6孔板，每個培養(yǎng)皿的細胞加2mlPBS沖洗2次，棄掉沖洗液。每個培養(yǎng)孔加入1mlTrizol，吹打，收集裂解液，-80℃低溫保存，備用。Trizol兩步法分別提取細胞總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測MMP-1，MMP-2，MMP-9，MMP-13，TIMP-1，TIMP-2的基因表達情況，并用軟件進行半定量分析。
　　 結(jié)果:

6、>　　 1.乏氧12h，24h，48h人牙周韌帶成纖維細胞MMP-2，TIMP-1，TIMP-2mRNA的表達高于對照組;乏氧48hMMP-1mRNA的表達高于對照組。
　　 2.乏氧組MMP-2mRNA的表達呈明顯遞增趨勢，與對照組相比差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 3.乏氧12h組MMP-1mRNA表達有一過性降低，隨著乏氧時間延長，其表達增加。乏氧12h組與常氧組相比差異無統(tǒng)計學意義。
　　 4.

7、乏氧12h組TIMP-1mRNA和TIMP-2mRNA表達有一過性升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著乏氧時間延長，其表達與對照組相比增加不明顯。乏氧組內(nèi)TIMP-1mRNA和TIMP-2mRNA的表達呈遞減趨勢。
　　 5.實驗中未檢測到MMP-9，13mRNA的表達，結(jié)果未顯示。
　　 6.乏氧48h后MMP-1/TIMP-1mRNA的比值變化較常氧組不明顯，但乏氧12h組MMP-1/TIMP-

8、1mRNA的比值明顯降低，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。乏氧組組內(nèi)MMP-1/TIMP-1mRNA的比值變化顯著，表達呈明顯遞增趨勢。
　　 7.乏氧12h，24h，48h組MMP-2/TIMP-2mRNA的比值較常氧組明顯上升，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 乏氧可以導致MMP-1，MMP-2，TIMP-1，TIMP-2的表達，并使MMP-2/TIMP-2的表