TWEAK通過NF-κB途徑促進大鼠心肌成纖維細胞增殖并表達基質(zhì)金屬蛋白酶9.pdf

1、背景:
　　 心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)主要表現(xiàn)為心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)數(shù)目的增多和心肌細胞外間質(zhì)膠原的過度沉積，可存在于多種心血管系統(tǒng)疾病。心肌纖維化造成心肌僵硬度增加，使心室的收縮和舒張功能下降，并影響心肌電生理，可導致心力衰竭、心律失常和心源性猝死等并發(fā)癥，嚴重危害人類身體健康。心肌纖維化是高血壓性心臟病的主要病理基礎(chǔ)之一。近年來，隨著高血壓病發(fā)病率

2、的增高，高血壓性心肌纖維化的發(fā)生機制和預(yù)防成為國內(nèi)外研究的熱點。
　　 高血壓心肌纖維化的病理生理過程是非常復(fù)雜的。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在其病理過程中發(fā)揮了重要的作用，MF被認為是高血壓、激素異常分泌和炎癥反應(yīng)之間反復(fù)相互作用的結(jié)果，是一個慢性炎癥反應(yīng)過程。
　　 腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是腫瘤

3、壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族的新成員，可在多種組織細胞中表達。TWEAK除具備TNF超家族的共同結(jié)構(gòu)特征和對腫瘤細胞有殺傷作用外，還有調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖及凋亡，促炎性反應(yīng)及血管生成等作用。TWEAK能夠通過刺激細胞分泌多種炎性因子，促進心肌成纖維細胞的增殖和膠原表達增多，從而促進心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展，但其機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是介導血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ

4、，Ang Ⅱ)、TNF-α促心肌成纖維細胞增殖和膠原表達作用的關(guān)鍵因子?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)被證實在細胞外基質(zhì)重塑及心肌纖維化過程中起主要作用。但TWEAK與NF-κB、MMP9在心肌纖維化中的關(guān)系尚未見報道。
　　 目的:
　　 研究腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(TWEAK)對大鼠心肌成纖維細胞NF-κB通路的影響及作用機制，探討NF-κB、MMP9等因子與心

5、肌纖維化的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.采用胰酶消化法培養(yǎng)新生Wistar大鼠心肌成纖維細胞，倒置顯微鏡觀察大鼠心肌成纖維細胞的形態(tài)，波形蛋白免疫熒光法鑒定心肌成纖維細胞。實驗選用第2～4代細胞。
　　 2.采用qRT-PCR法檢測兩組NF-κB和MMP9基因表達
　　 實驗共分兩組，對照組:不加干預(yù)因素;TWEAK組:加入rhTWEAK，使其濃度達100μg/L。繼續(xù)培養(yǎng)6h后分別提取RNA檢測NF-

6、κB的表達情況，24h后分別提取RNA檢測MMP9的表達情況。
　　 3.采用Westernblot法檢測NF-κB和MMP9蛋白表達
　　 TWEAK干預(yù)后檢測NF-κB的蛋白表達:①濃度梯度組:按rhTWEAK的終濃度分為對照組(0μg/L)、1μg/L組、10μg/L組、100μg/L組和200μg/L組，繼續(xù)孵育8h后提取核蛋白;②時間梯度組:培養(yǎng)液換為含100μg/LrhTWEAK的無血清DMEM繼續(xù)孵育，按分

7、組不同分別孵育0、3、6、9、12h后提取核蛋白。
　　 TWEAK和PDTC干預(yù)后檢測NF-κB蛋白的表達:①TWEAK組:培養(yǎng)液換為含100μg/LrhTWEAK的無血清DMEM，繼續(xù)孵育6h后提取核蛋白;②TWEAK+PDTC組:培養(yǎng)液換為含100μg/LrhTWEAK和100μmol/LPDTC的無血清DMEM，繼續(xù)孵育6h后提取核蛋白。
　　 TWEAK和PDTC干預(yù)后檢測MMP9的蛋白表達:TWEAK+PDT

8、C組:培養(yǎng)液換為含100μg/LrhTWEAK和100μmol/LPDTC的無血清DMEM，繼續(xù)孵育24h后提取蛋白;②刺激組:換含100μg/LrhTWEAK的無血清DMEM，繼續(xù)孵育24h后提取蛋白;③對照組:只加無血清DMEM，繼續(xù)孵育24h后提取蛋白。
　　 4.四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定TWEAK和PDTC干預(yù)后細胞增殖情況
　　 培養(yǎng)CFs至指數(shù)生長期，調(diào)整細胞密度為5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，

9、培養(yǎng)24h后，換DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24h后分組:①TWEAK+PDTC組:換含100ug/LrhTWEAK和100umol/LPDTC的DMEM;②TWEAK組:換含100ug/LrhTWEAK的DMEM;③對照組:只加DMEM。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，MTT法測定各組細胞增殖情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.qRT-PCR檢測NF-κB和MMP9的表達，刺激組NF-κB(5.3517)和MMP9(5.8971)mRNA表

10、達水平顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　 2.不同濃度的rhTWEAK刺激8h后，NF-κB蛋白表達呈現(xiàn)劑量依賴性增加。對照組（0.510±0.011）、1μg/L組(0.860±0.069)、10μg/L組（1.224±0.010）、100μg/L組（1.908±0.055）表達依次增加(n=3)(P＜0.01)。而200μg/LrhTWEAK組（1.942±0.069）與100μg/L組相比未見顯著性變化(P＞0.05)

11、。
　　 3.100μg/LrhTWEAK刺激3h后NF-κB蛋白表達（0.815±0.063）開始增加，6h后（1.426±0.056）達到最大值，12h后（0.456±0.048）明顯衰減(n=3)(P＜0.01)。
　　 4.100ug/LrhTWEAK作用24h后，與對照組(0.232±0.010)相比，刺激組(0.871±0.018)MMP9表達明顯增加;用100umol/LPDTC抑制NF-κB表達后，TWE

12、AK+PDTC組(0.422±0.022)MMP9表達較刺激組顯著減少(n=3)(P＜0.01)。
　　 5.100ug/LrhTWEAK作用后刺激組A492值顯著高于對照組(P＜0.01)，用100umol/LPDTC抑制NF-κB后，TWEAK+PDTC組A492值明顯降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.rhTWEAK可促進大鼠成纖維細胞的NF-κB和MMP9mRNA表達上調(diào)，蛋白表達明顯增加，同