TWEAK通過P38MAPK途徑促進大鼠心肌成纖維細胞Ⅰ型膠原和MMP-1表達.pdf

1、背景:
　　 高血壓為最常見的慢性病，在其發(fā)生、發(fā)展的進程中，可導致心血管系統(tǒng)、腦、腎臟等多器官并發(fā)癥，嚴重威脅著人類健康。心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)作為高血壓病心肌損害的主要病理基礎，表現(xiàn)為心肌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)膠原的過度沉積和肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)數(shù)目的增多，進而影響心室壁動度及心室的舒張及收縮功能，從而導致嚴

2、重心律失常、心功能不全及心源性猝死等嚴重并發(fā)癥。因此，高血壓心肌纖維化的發(fā)生機制和防治措施已成為近年來國內(nèi)外研究熱點。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)MF是一個復雜的病理過程受免疫系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）和多種細胞因子調(diào)控。而炎癥因子作為參與調(diào)控MF的重要因素在其發(fā)生、發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用。
　　 在諸多的細胞因子中，TNF超家族作為一個有多重生物學效應的促炎反應因子，與多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。TNF

3、是一組具有多樣生物學效應的促炎反應細胞因子，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。如:TNF-α表達升高可導致心功能不全及心肌病并且TNF-α還參與糖尿病大鼠心肌炎癥反應及纖維化。作為TNF超家族中的新成員腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(TWEAK)，于1997年發(fā)現(xiàn)其主要由淋巴樣細胞表達，在其合成之初為Ⅱ型膜結(jié)合蛋白，隨后很快被furin酶水解成具有生物學活性的可溶性的小片段。Fn14主要由非淋巴樣細胞，如上皮細胞、內(nèi)皮細胞、間充質(zhì)細胞中表達，作為

4、TWEAK特異性相關(guān)受體為人們所熟知，是Ⅰ型跨膜蛋白。TWEAK和Fn14廣泛表達于各種組織及細胞內(nèi)，在胰腺、腸、心臟、大腦、肺、卵巢及骨骼肌中均有TWEAKmRNA的表達，在肝臟及腎臟中亦少量表達。近年TWEAK及其特異性受體Fn14在創(chuàng)傷修復及組織再生方面介導多種炎癥反應受到越來越多的關(guān)注，TWEAK作為一種促炎及促血管生成的細胞因子介導多種細胞的生長、增殖、凋亡，促炎性反應和血管生成等作用。研究發(fā)現(xiàn)TWEAK與其受體Fn14結(jié)合主

5、要通過核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)途徑等多個下游信號通路的瀑布樣反應發(fā)揮作用。隨著研究深入，TWEAK與其受體Fn14促進AS、MF及介導心肌重塑等在心血管系統(tǒng)過程中所發(fā)揮的的作用越來越得到重視。TWEAK/Fn14能促進內(nèi)皮功能不全、增強炎癥反應、促進

6、平滑肌細胞增殖及遷移、上調(diào)MMPs表達、促進細胞死亡，參與動脈粥樣硬化斑塊進展，促使其不穩(wěn)定，進而導致急性冠脈綜合征的發(fā)生。在ST段抬高型急性心肌梗死病人時血清可溶性TWEAK(sTWEAK)顯著升高，其升高程度與病人的短期預后密切相關(guān)。在心肌纖維化方面，研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)心肌中Fn14表達明顯增強，F(xiàn)n14可能參與SHR心肌纖維化的過程，培哚普利可能通過抑制其

7、表達減輕心肌纖維化。進而在體外細胞水平發(fā)現(xiàn)TWEAK/Fn14明顯促進CFs中NF-κB和MMP9mRNA及蛋白表達，而以PDTC抑制NF-κB通路后，CFs增殖降低且MMP9表達減少。進而揭示TWEAK通過激活經(jīng)典的NF-κB通路能促CFs增殖和膠原合成，參與心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程發(fā)現(xiàn)。Chen等研究發(fā)現(xiàn)TWEAK通過激活經(jīng)典的NF-κB通路，促進大鼠CFs增殖和Ⅰ/Ⅲ膠原合成，促進心肌纖維化進展。然而，在心肌纖維化方面相關(guān)研究發(fā)

8、現(xiàn)，TWEAK作為一種具有多種活性的炎癥因子，除能激活經(jīng)典的NF-κB通路外，還可通過介導Fn14激活非經(jīng)典的NF-κB通路以及MAPK通路，然而相關(guān)研究未見報道。因此，本文通過觀察TWEAK介導P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38MAPK)通路對大鼠心肌成纖維細胞中膠原代謝影響，及MMP-1表達的影響，以迸一步明確TWEAK參與心肌纖維化的機制。
　　 目

9、的:
　　 探討腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑(TWEAK)影響心肌成纖維細胞(CFs)中Ⅰ型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）表達的作用機制。
　　 方法:
　　 1.采用胰蛋白酶消化法及時間差法培養(yǎng)并純化新生Wistar大鼠心肌成纖維細胞。并采用倒置顯微鏡及波形蛋白免疫熒光法觀察并鑒定心肌成纖維細胞。
　　 2.加入重組人TWEAK(rhTWEAK

10、)及P38MAPK抑制劑(SB203580)干預。
　　 將實驗分為:
　　 ①對照組:不加干預因素;
　　 ②TWEAK組:加入100ng/mLTWEAK;
　　 ③TWEAK+SB203580組:加入100ng/mLTWEAK+SB203580。
　　 3.各實驗組分別采用MTT法檢測CFs增殖;western blot法檢測Ⅰ型膠原蛋白及磷酸化P38MAPK(P-P38MAPK)蛋白表達;q

11、RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原mRNA表達;ELASA法檢測CFs細胞培養(yǎng)液中MMP-1的濃度。
　　 結(jié)果:
　　 1.CFs的形態(tài)觀察及鑒定
　　 培養(yǎng)48h后，CFs已長滿或接近長滿單層培養(yǎng)瓶，長滿或接近長滿單層。于倒置顯微鏡下觀察，CFs多呈梭形，無自發(fā)性搏動。其細胞核較大，胞漿透明。采用波形蛋白免疫熒光鑒定，CFs的波形蛋白呈現(xiàn)陽性反應，其胞漿內(nèi)圍繞胞核呈現(xiàn)綠色網(wǎng)絡狀物質(zhì)。
　　 2.干預因素對CF

12、s增殖的影響
　　 rhTWEAK干預心肌成纖維細胞48h后，對照組(0.302±0.019)，TWEAK組(0.493±0.042)，TWEAK+SB203580組(0.362±0.039)三者間相比較，TWEAK組較對照組可顯著促進CFs增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而TWEAK+SB203580組較對照組比較也可促進心肌成纖維細胞增殖(P＞0.05)。SB203580干預組及未干預組比較，CFs增殖程度降低，差異

13、具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 3.各組對Ⅰ型膠原mRNA和Ⅰ型膠原蛋白的表達
　　 以上各實驗組終止干預后，測定以上各組中Ⅰ型膠原mRNA表達分別為TWEAK組(6.080±0.676)，TWEAK+SB203580組(3.400±0.810)。與對照組比較，TWEAK組及TWEAK+SB203580組中Ⅰ型膠原mRNA表達水平明顯增多，差異間具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在特異性阻斷P38MAPK通路后，其

14、Ⅰ型膠原mRNA表達水平較TWEAK組降低，二者間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖3a。與對照組比較，二者Ⅰ型膠原蛋白表達明顯升高差異(P＜0.05)。同TWEAK組相比，TWEAK+SB203580組中Ⅰ型膠原蛋白較其減少42.6％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.各組CFs中P-P38MAPK蛋白的表達
　　 各實驗組間相比，TWEAK組較對照組及TWEAK+SB203580組，可明顯促進CFs中

15、P-P38MAPK蛋白表達(P＜0.01)。TWEAK+SB203580組與對照組相比，TWEAK+SB203580組部分抑制P-P38MAPK蛋白表達(P＜0.05)。
　　 5.各組CFs中MMP-1的表達
　　 各實驗組終止干預后，應用ELISA法測定各組心肌成纖維細胞中MMP-1濃度，TWEAK組較其他兩組明顯上調(diào)CFs中MMP-1表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。TWEAK+SB203580組與TWEAK

16、組相比，部分抑制心肌成纖維細胞培養(yǎng)液中MMP-1的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.TWEAK/Fn14可顯著促進大鼠心肌成纖維細胞增殖，上調(diào)細胞中Ⅰ型膠原mRNA及Ⅰ型膠原蛋白和P-P38MAPK蛋白表達，并促進炎癥因子MMP-1表達。
　　 2.應用SB203580后，可部分抑制TWEAK促進心肌成纖維細胞增殖程度，并部分抑制細胞中Ⅰ型膠原mRNA、Ⅰ型膠原蛋白和P-P38MA