牙髓和牙周韌帶細胞體外培養(yǎng)和誘導礦化的基因表達研究.pdf

1、牙髓和牙周韌帶組織再生修復是構建組織工程生物牙根的關鍵，其目標是重建具有生物學活性和功能的組織。人牙髓細胞(dental pulp cells，DPCs)和牙周韌帶細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是構建生物牙根的種子細胞，具有克隆形成、自我更新和多向分化能力。由于牙髓和牙周韌帶組織來源和生物學功能不盡相同，DPCs和PDLCs性能各異。比較研究DPCs和PDLCs體外培養(yǎng)和誘導礦化的基因表達，對口

2、腔組織工程提供可靠的種子細胞來源有重要意義。細胞培養(yǎng)微環(huán)境與細胞多能性維持有緊密關系。長期體外培養(yǎng)可使細胞增殖和分化能力進行性下降。應激狀態(tài)可激活相關信號通路，促使體細胞去分化，行使修復功能，改變培養(yǎng)條件和微環(huán)境可能誘導細胞出現(xiàn)去分化。如何使靜止期的細胞重新進入細胞周期，由已分化狀態(tài)去分化為未分化狀態(tài)，從而改變細胞性狀，尚需進一步研究。牙髓牙本質復合體和牙周附著裝置修復再生是復雜的生物過程，涉及細胞增殖、遷移、分化、修復性組織形成等，受

3、Notch、Wnt、TGF-β/BMP及Cadherin等信號網絡調控。目前，關于DPCs和PDLCs體外誘導分化和組織再生的調控機制尚不清楚，對人牙源性細胞分化的分子標記和調控信號研究將有助于闡明牙組織修復再生機制。
　　 本研究采用實時熒光定量RT-PCR芯片等方法檢測DPCs和PDLCs體外連續(xù)培養(yǎng)過程中干細胞相關基因Sox2、Oct-4和c-Myc的表達變化，揭示細胞多能性維持和細胞老化的調控機制，為進一步探索體外培養(yǎng)細

4、胞多能性維持的方法提供新思路；比較DPCs和PDLCs體外成牙本質/成骨分化的能力及差異表達基因變化，揭示成牙本質/成骨分化的信號調控機制，對利用DPCs和PDLCs進行臨床治療有積極意義。本研究分為兩個部分：
　　 第一章：干細胞相關基因在體外培養(yǎng)的牙髓和牙周韌帶-細胞的表達。
　　 目的：檢測DPCs和PDLCs體外培養(yǎng)過程干細胞相關基因Sox2、Oct-4和c-Myc的表達，探討體外連續(xù)培養(yǎng)對干細胞性能的影響，揭示

5、干細胞相關基因對體外培養(yǎng)牙源性細胞多能性的調控機制。
　　 方法：取成人健康阻生第三磨牙或正畸拔除雙尖牙的牙髓和牙周韌帶組織，免疫熒光染色檢測體外培養(yǎng)組織Sox2、Oct-4和c-Myc的表達，未經體外培養(yǎng)的組織為對照組。組織塊接種法培養(yǎng)DPCs和PDLCs，取第0、2和7代細胞，免疫熒光染色和實時定量熒光RT-PCR檢測Sox2、Oct-4和c-Myc表達，統(tǒng)計學分析。
　　 結果：免疫熒光顯示Sox2、Oct-4和c

6、-Myc在體外培養(yǎng)4w的組織呈陽性表達，對照組無表達。Sox2、Oct-4和c-Myc熒光表達隨傳代由細胞核轉移到細胞漿，第0和第2代間細胞核陽性率差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，第7代細胞核陽性率顯著降低(p＜0.05)。實時定量熒光RT-PCR顯示Sox2和Oct-4 mRNA在DPCs和PDLCs體外傳代培養(yǎng)中呈相似的表達模式，隨DPCs和PDLCs傳代先上升后下降(p＜0.05)；c-Myc mRNA隨DPCs傳代先上升后下降

7、，而隨PDLCs傳代持續(xù)上調(p＜0.05)。
　　 結論：細胞體外培養(yǎng)微環(huán)境可激活DPCs和PDLCs中干細胞相關基因表達，DPCs和PDLCs體外培養(yǎng)過程可能存在自發(fā)去分化。擴增早期的DPCs和PDLCs中Sox2、Oct-4和c-Myc表達水平較高，是應用于口腔再生醫(yī)學的理想模型。Sox2和Oct-4在牙源性細胞體外連續(xù)培養(yǎng)中呈相似的表達模式，可能對細胞多能性維持存在協(xié)同調控作用。
　　 第二章：牙髓和牙周韌帶細胞

8、的礦化能力比較研究。
　　 目的：誘導礦化DPCs和PDLCs，檢測和比較DPCs和PDLCs礦化能力，為闡明兩種細胞礦化過程的信號調控機制提供實驗依據。
　　 方法：酶消化法培養(yǎng)DPCs和PDLCs，取第3代細胞培養(yǎng)于成牙本質/成骨誘導培養(yǎng)基。Von Kossa染色，ImageJ軟件圖象分析。取礦化誘導0、7、14和21d的細胞，檢測ALP和鈣離子活性變化，統(tǒng)計學分析。
　　 結果：礦化誘導14d，DPCs和P

9、DLCs分泌礦化基質，Von Kossa染色顯示礦化結節(jié)形成，ImageJ結果示兩者礦化結節(jié)數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，PDLCs礦化結節(jié)面積顯著大于DPCs(p＜0.05)。礦化誘導7、14和21d，PDLCs的鈣離子活性均顯著高于DPCs(p＜0.05)；礦化誘導14d，PDLCs的ALP活性顯著高于DPCs(p＜0.05)，其余時間點兩者ALP活性差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 結論：酶消化法分離培養(yǎng)的

10、DPCs和PDLCs經誘導可向成牙本質/成骨樣細胞分化，PDLCs的礦化結節(jié)面積、ALP活性和鈣離子活性均顯著高于DPCs，提示體外培養(yǎng)的PDLCs礦化能力強于DPCs。
　　 第三章：牙髓和牙周韌帶細胞向成牙本質/成骨樣細胞分化的基因表達研究。
　　 目的：檢測和比較DPCs和PDLCs向成牙本質/成骨樣細胞分化的差異表達基因，尋找DPCs和PDLCs分化的分子標記，揭示DPCs和PDLCs分化及組織再生的調控機制。<

11、br>　　 方法：取第3代DPCs和PDLCs礦化誘導14d，實時熒光定量RT-PCR芯片檢測誘導前后差異表達基因，數(shù)據分析并篩選表達差異大于3倍的基因；建立大鼠牙髓牙周聯(lián)合損傷修復模型，免疫熒光染色驗證部分差異表達基因。
　　 結果：礦化誘導后，DPCs和PDLCs分別有差異表達基因7和16個，其中DPCs5個基因上調，2個基因下調；PDLCs5個基因上調，11個基因下調。細胞處于未分化狀態(tài)時，PDLCs中6個基因表達顯著高

12、于DPCs，4個基因表達顯著低于DPCs；礦化誘導后，PDLCs中4個基因表達顯著高于DPCs，10個基因表達顯著低于DPCs。DPCs和PDLCs礦化過程涉及Notch、Wnt、TGF-β/BMP及Cadherin等信號通路(APC、DLL1、CCND2、BMP2和CDH1)。免疫熒光染色檢測BMP2和CDH1在大鼠牙髓牙周聯(lián)合損傷修復中的表達，與實時熒光定量RT-PCR芯片結果一致。
　　 結論：獲得DPCs和PDLCs向成