機(jī)械牽張和間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向韌帶細(xì)胞分化的體外研究.pdf

1、韌帶在維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定，協(xié)調(diào)關(guān)節(jié)運(yùn)動中發(fā)揮著重要作用。外傷、長期反復(fù)勞累過度等會造成韌帶損傷，但由于韌帶組織血供少，損傷后很難完全愈合，最終造成關(guān)節(jié)功能嚴(yán)重障礙的病例。韌帶損傷也使得很多優(yōu)秀的運(yùn)動員就此葬送了運(yùn)動生涯?，F(xiàn)代外科的發(fā)展已使人類替換病損韌帶成為現(xiàn)實(shí)，外科使用過的替換物包括異種韌帶、同種異體韌帶、自體韌帶和人工合成材科等，但這些措施的遠(yuǎn)期效果都不夠理想。組織工程學(xué)的誕生使體外構(gòu)建有活性的生物韌帶的研制成為可能，為這一疾病的治療提供

2、了新途徑細(xì)胞成分對提高韌帶的力學(xué)負(fù)載的承受力，基因激活和韌帶自我更新和調(diào)節(jié)的能力非常重要。但如何選擇理想的種子細(xì)胞?種子細(xì)胞需要怎樣的微環(huán)境才能達(dá)到預(yù)期的功能要求?這些問題都有待進(jìn)一步研究。 本試驗(yàn)的目的是：探索在體外條件下如何誘導(dǎo)BMSCs向韌帶成纖維細(xì)胞分化。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們采用與韌帶成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)和力學(xué)刺激兩種方法，研究體外條件下誘導(dǎo)BMSCs向韌帶成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，試圖為體外誘導(dǎo)BMSCs向韌帶成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化提供可

3、研究方法： 1．采用Percoll液密度梯度離心法和傳代貼壁篩選法相結(jié)合分離獲得骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，建立大鼠BMSCs(rBMSCs)和人BMSCs(hBMSCs)體外培養(yǎng)的方法；通過形態(tài)學(xué)方法與細(xì)胞表面特異抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測方法，對在體外所培養(yǎng)的rBMSCs和hBMSCs進(jìn)行鑒定：采用體外誘導(dǎo)rBMSCs和hBMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞分化的方法，對BMSCs的干細(xì)胞生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定。 2．實(shí)時熒光定量PCR檢測第一代

4、到第六代大鼠BMSCs Ⅰ型膠原蛋白，Ⅲ型膠原蛋白和韌粘素-C mRNA的表達(dá)。 3．將大鼠BMSCs和大鼠韌帶成纖維細(xì)胞間接共培養(yǎng)3、6、12天，用實(shí)時熒光定量PCR檢測，間接共培養(yǎng)后BMSCs三種韌帶特性蛋白(Ⅰ型膠原蛋白，Ⅲ型膠原蛋白和韌粘素-C)的mRNA表達(dá)；競爭放免法和免疫組化的方法，檢測細(xì)胞這三種蛋白合成。 4．對大鼠BMSCs施以10％，1 赫茲的周期性牽張刺激不同時段后，分析細(xì)胞的變形和重排；并用實(shí)時熒

5、光定量PCR檢測牽張不同時間段后，其Ⅰ型、Ⅲ型膠原和韌粘素-C mRNA的表達(dá)；用競爭放免法和免疫組化，檢測細(xì)胞這三種蛋白合成；激光共聚焦顯微鏡觀察力學(xué)刺激對細(xì)胞骨架的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．成功獲得了rBMSCs和hBMSCs兩種干細(xì)胞。我們獲得的細(xì)胞具有干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(核大漿少)；細(xì)胞表面特異性抗原鑒定(rBMSCs CD44、CD90表達(dá)陽性而CD34、CD45表達(dá)陰性，hBMSCsCD44表達(dá)陽性CD14、CD

6、45表達(dá)陰性)，且這些特征在第一代到第六代的細(xì)胞中穩(wěn)定：rBMSCs和hBMSCs這兩種細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。綜合上述三個特點(diǎn)，我們認(rèn)為實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和韌粘素-C mRNA在第一代到第六代大鼠BHSCs中均穩(wěn)定表達(dá)。 3.間接共培養(yǎng)6天，BMSCsⅠ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA表達(dá)分別是對照組的2.0和2.2倍，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA與內(nèi)參照GAPDH

7、的相對表達(dá)量在間接共培養(yǎng)6天組分別為：3.9±0.2和1.9±0.2，對照組分別為：1.9±0.3和0.8±0.1，間接共培養(yǎng)組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)而韌粘素-C的表達(dá)無明顯改變。間接共培養(yǎng)12天，Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白含量增加，分別從對照組的12.4±0.8 ng/μg和5.0±0.4 ng/μg增加到間接共培養(yǎng)組的13.6±1.3 ng/μg和5.9±0.5 ng/μg，間接共培養(yǎng)組與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.

8、05)；韌粘素-CmRNA的表達(dá)，為對照組的2.0倍，對照組和間接共培養(yǎng)組的相對表達(dá)量分別為0.07±0.02和0.14±0.02。 4.力學(xué)刺激使細(xì)胞胞體較對照組變細(xì)長，細(xì)胞重新定向排列在遠(yuǎn)離牽張力方向60～80°和100～130°這兩個以90°軸對稱的區(qū)域。力學(xué)刺激12小時后，BMSCsⅠ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)與對照組相比增高有顯著差異(P<0.05)；24小時后，兩種膠原蛋白的合成有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。韌粘素-C mRNA

9、的表達(dá)在力學(xué)作用24h和36h后，分別增高到對照組的2.65±0.03和2.89±0.04倍；細(xì)胞骨架在力學(xué)刺激作用下亦發(fā)生了改變，F(xiàn)-actin隨牽張時間增長，含量逐漸減少。 結(jié)論 1.我們分離獲得的rBMSCs和hBMSCs細(xì)胞具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力，且它們表面特征分子和膠原蛋白，在第一代到第六代的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。 2.Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和韌粘素-C mRNA在第一代到第六代BMSCs中穩(wěn)定表達(dá)。