凝血酶是治療轉(zhuǎn)移性骨橋蛋白陽性肝細(xì)胞肝癌的靶點(diǎn).pdf

1、我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明骨橋蛋白(OPN)是促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子之一，并且通過體內(nèi)外試驗(yàn)確定為干預(yù)肝細(xì)胞肝癌侵襲轉(zhuǎn)移潛在的靶點(diǎn)。而絲氨酸蛋白酶凝血酶能和骨橋蛋白相互作用并且調(diào)節(jié)它的生物活性。為了研究凝血酶單獨(dú)以及與骨橋蛋白協(xié)同在肝細(xì)胞肝癌的作用，我們在具有不同的骨橋蛋白表達(dá)水平肝癌患者中，研究了凝血酶的表達(dá)水平與不同骨橋蛋白背景的肝癌患者預(yù)后的聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)凝血酶的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，并且與癌旁組織相比，

2、癌組織的凝血酶表達(dá)水平顯著上升。另外，發(fā)生復(fù)發(fā)的患者的癌組織與未復(fù)發(fā)的患者相比，凝血酶的表達(dá)水平顯著升高。對230例患者的免疫組化研究表明，只有骨橋蛋白表達(dá)水平較高的患者，凝血酶的表達(dá)水平才與患者的總體生存(OS；P<0.01)與至復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR；P<0.0001)相關(guān)。體外試驗(yàn)表明，凝血酶能夠有效促進(jìn)骨橋蛋白過表達(dá)肝癌細(xì)胞株的增殖和黏附能力，體內(nèi)試驗(yàn)證明凝血酶有效促進(jìn)了人肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)人肝癌裸鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移可被凝血酶

3、抑制劑阿加曲班所抑制。并且在體外觀察了原核表達(dá)的骨橋蛋白全長與凝血酶切片段對肝癌細(xì)胞增殖與黏附能力的影響，發(fā)現(xiàn)氨基端片段比全長擁有更強(qiáng)的促增殖與黏附能力。同時(shí)外源性凝血酶的處理能夠激活骨橋蛋白高表達(dá)細(xì)胞株FAK信號通路，并且這種激活效應(yīng)能夠被整合素拮抗性抗體所阻斷。結(jié)論：凝血酶在骨橋蛋白介導(dǎo)的侵襲性表型和肝細(xì)胞肝癌較差預(yù)后中發(fā)揮重要作用，這種作用可能是通過激活整合素受體-FAK信號通路引起的。因此，凝血酶可能是對抗凝血酶骨橋蛋白雙陽性患

4、者侵襲轉(zhuǎn)移潛在的靶點(diǎn)。
　　第一部分凝血酶在肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá)
　　目的：通過檢測肝癌組織、癌旁和正常肝組織中凝血酶的mRNA與蛋白表達(dá)以及不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞以及正常肝細(xì)胞凝血酶的mRNA與蛋白表達(dá)，分析其與肝癌惡性行為的關(guān)系。
　　方法：應(yīng)用熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)技術(shù)以及Western blot檢測凝血酶在肝癌、相應(yīng)癌旁、正常肝組織中的表達(dá)，并比較三組間凝血酶的表達(dá)差異；應(yīng)用熒光定量PCR及Western b

5、lot檢測不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞以及正常肝細(xì)胞凝血酶的mRNA與蛋白表達(dá)，比較不同細(xì)胞株之間凝血酶的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：通過熒光定量PCR以及Western blot技術(shù)，發(fā)現(xiàn)六株肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞株(L-02和Chang liver細(xì)胞株)相比，凝血酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。以HepG2、PLC和MHCC97-L細(xì)胞株為代表的低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞和以MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6為代表的高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)

6、胞株與低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株相比，高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株凝血酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.0001)。我們通過熒光定量PCR同時(shí)檢測了20例正常肝臟組織和72例肝癌組織以及相應(yīng)的癌旁組織凝血酶mRNA的表達(dá)水平。凝血酶在肝癌、相應(yīng)癌旁和正常肝組織中均有表達(dá)，相對表達(dá)量分別為(2-△Ct，137.4±69.1)，2.7±0.1(0.0-6.5)與1.8±0.8(0.0-3.1)，肝癌與相應(yīng)癌旁組織間差異明顯(P=0.005)，凝血酶

7、在癌旁與正常肝組織的表達(dá)也存在差異(2-△Ct，分別為22.2±7.6和19.9±8.7)(p<0.05)。同時(shí)，凝血酶在肝癌組織mRNA的表達(dá)水平與肝癌復(fù)發(fā)正相關(guān)(P=0.037)，這點(diǎn)得到了Western blot結(jié)果的驗(yàn)證。免疫組織化學(xué)顯示凝血酶主要分布于細(xì)胞周質(zhì)，其在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁(p<0.05)。
　　結(jié)論：凝血酶在肝癌細(xì)胞株以及肝癌組織中高表達(dá)，并且凝血酶在肝癌的惡性行為中可能具有重要作用。
　　第

8、二部分凝血酶屑橋蛋白與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系
　　目的：研究凝血酶和骨橋蛋白在原發(fā)性肝癌中表達(dá)，探討凝血酶和OPN與原發(fā)性肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及臨床生物學(xué)意義。
　　方法：應(yīng)用熒光定量PCR檢測72例肝癌組織中凝血酶與OPN mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測230例肝癌組織中凝血酶與骨橋蛋白的表達(dá)，SSPS15.0分析兩者與肝癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：肝癌組織凝血酶和骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平的相關(guān)

9、性分析表明，它們的表達(dá)量并不存在聯(lián)系(r=-0.17，p=0.15)。為了觀察凝血酶是否參與了骨橋蛋白相關(guān)肝癌患者的預(yù)后，我們根據(jù)骨橋蛋白表達(dá)水平的中位值作為閾值將肝癌患者分為低表達(dá)和高表達(dá)組。發(fā)現(xiàn)在骨橋蛋白高表達(dá)組，復(fù)發(fā)患者的凝血酶表達(dá)水平比未復(fù)發(fā)的患者顯著提高(P=0.027)。這樣的差異并沒有出現(xiàn)在骨橋蛋白低表達(dá)組患者中(P=0.457)。我們用免疫組化技術(shù)在230例肝癌患者中評估凝血酶和骨橋蛋白在肝癌中的蛋白表達(dá)水平，并且分析了

10、與他們的預(yù)后的關(guān)系。凝血酶和骨橋蛋白的陽性率分別為33％(77/230)和39％(90/230)。其中15.7％(36/230)的患者同時(shí)陽性標(biāo)記。我們發(fā)現(xiàn)凝血酶過表達(dá)與肝癌患者的腫瘤大小(P=0.0438)、血管侵犯(P=0.0317)、TNM(P=0.0187)分期等臨床病理因素有關(guān)。在骨橋蛋白過表達(dá)的患者組中，凝血酶過表達(dá)與血清AFP(P=0.0304)、腫瘤大小(P=0.0024)、血管侵犯(P=0.0018)、TNM分期(P=

11、0.0008)、腫瘤分化(P=0.0373)以及腫瘤包膜完整(P=0.0477)相關(guān)。但是，在骨橋蛋白低表達(dá)患者組中并沒有發(fā)現(xiàn)凝血酶過表達(dá)與這些臨床病理特征之間的聯(lián)系。凝血酶蛋白水平的過表達(dá)與至復(fù)發(fā)時(shí)間顯著相關(guān)(P=0.021)，并且在骨橋蛋白過表達(dá)患者組中這種聯(lián)系更強(qiáng)(P=0.0001)，而在骨橋蛋白低表達(dá)患者組中并沒有發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)系(P=0.728)。凝血酶過表達(dá)的肝癌患者1-，3-和5-年累積復(fù)發(fā)率分別為41.6，67.5和68.8

12、％，顯著高于凝血酶低表達(dá)的肝癌患者(24.8，43.1和47.1％；P=0.0001)。凝血酶過表達(dá)的肝癌患者1-，3-，5-年總生存率分別為75.3，42.9和40.2％，顯著低于凝血酶低表達(dá)的肝癌患者(85.6，59.5和57.5％；P=0.005)。將230例肝癌患者根據(jù)骨橋蛋白的表達(dá)水平分為骨橋蛋白過表達(dá)組與低表達(dá)組，在骨橋蛋白過表達(dá)組中，凝血酶的過表達(dá)患者(thrombin+/OPN+)與低表達(dá)患者(thrombin+/thr

13、ombin-)相比，至復(fù)發(fā)時(shí)間更短(P=0.001)，1-，3-和5-年累積復(fù)發(fā)率(47.2，86.1和88.9％)顯著高于低表達(dá)組患者(20.4，42.6和46.4％；P<0.0001)。thrombin+/OPN+組患者1-，3-，5-年的總生存率(72.2，27.8和22.2％)顯著低于thrombin-/OPN+組患者(85.2，61.1和55.2％，P=0.001)。而在骨橋蛋白低表達(dá)患者組中，凝血酶表達(dá)水平的差異與生存和復(fù)發(fā)

14、并無聯(lián)系(TTR，P=0.728；OS，P=0.596)。
　　結(jié)論：凝血酶/骨橋蛋白過表達(dá)可以預(yù)測肝細(xì)胞肝癌的預(yù)后，凝血酶可能參與了骨橋蛋白介導(dǎo)的肝癌惡性表型。
　　第三部分凝血酶促進(jìn)骨橋蛋白陽性肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移
　　目的：研究凝血酶與骨橋蛋白陽性肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的關(guān)系
　　方法：轉(zhuǎn)染pOPN-GFP質(zhì)粒和Pegfp-N1對照質(zhì)粒，篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株，經(jīng)westernblot和熒光倒置顯微鏡驗(yàn)證篩選出的穩(wěn)定

15、細(xì)胞株；CCK-8檢測加入外源性的凝血酶后對不同骨橋蛋白表達(dá)水平肝癌細(xì)胞增殖能力的變化；細(xì)胞外基質(zhì)試劑盒研究加入外源性的凝血酶后，不同骨橋蛋白表達(dá)水平細(xì)胞黏附能力的改變；細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射途徑注入裸鼠體內(nèi)，研究外源性的凝血酶對不同OPN表達(dá)水平肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移能力的改變；高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株HCCLM3接種于裸鼠皮下，研究凝血酶抑制劑阿加曲班的干預(yù)對細(xì)胞成瘤與肺轉(zhuǎn)移能力的改變。
　　結(jié)果：低轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株P(guān)LC穩(wěn)定轉(zhuǎn)染野生型OPN

16、真核質(zhì)粒及對照空白對照質(zhì)粒，OPN的蛋白表達(dá)水平通過Western blot驗(yàn)證后，分別命名為PLC-OPN和PLC-CON。PLC-OPN與PLC-CON細(xì)胞株相比，OPN表達(dá)水平顯著上調(diào)。體外增殖試驗(yàn)觀察兩個(gè)細(xì)胞株對凝血酶的處理(2 U/ml)的反應(yīng)差別，發(fā)現(xiàn)PLC-CON和PLC-OPN細(xì)胞株在普通培養(yǎng)條件下具有相似的增殖動(dòng)力學(xué)。而凝血酶處理后，PLC-OPN細(xì)胞株在對數(shù)生長期的增殖顯著上調(diào)(P<0.05)，而PLC-CON細(xì)胞株

17、并沒有出現(xiàn)這種增殖能力的改變。體外黏附試評估了PLC-CON和PLC-OPN細(xì)胞株凝血酶(2 U/ml)處理后，黏附能力的改變。發(fā)現(xiàn)，凝血酶的處理顯著增強(qiáng)了PLC-OPN細(xì)胞株對細(xì)胞外基質(zhì)分子的黏附能力，而PLC-CON并沒有發(fā)生這種改變。為了進(jìn)一步研究凝血酶影響體內(nèi)肝癌肺轉(zhuǎn)移的效應(yīng)，2 U/ml凝血酶處理過的PLC-OPN/PLC-CON細(xì)胞株通過尾靜脈注射注入裸鼠體內(nèi)，四周后處死裸鼠觀察肺轉(zhuǎn)移率和肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)。盡管每只裸鼠都發(fā)生肺轉(zhuǎn)移

18、，PLC-OPN細(xì)胞凝血酶處理組單個(gè)裸鼠平均肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)顯著高于非處理組(P<0.05)。然而，PLC-CON細(xì)胞處理組和非處理組并沒有顯著差別。體內(nèi)凝血酶抑制劑阿加曲班的干預(yù)，顯著降低了肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移率以及肺轉(zhuǎn)移造的數(shù)量，而對成瘤并無影響。HCCLM3肝癌細(xì)胞接種裸鼠皮下成瘤，10天后干預(yù)組接受凝血酶抑制劑阿加曲班的干預(yù)，對原發(fā)瘤大小并無顯著影響。六周后處死裸鼠觀察肺轉(zhuǎn)移率和肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)對照組裸鼠都發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，平均肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)為16

19、.7±8，以Ⅰ-Ⅱ期轉(zhuǎn)移灶為主，含部分Ⅲ-Ⅳ轉(zhuǎn)移灶。相反的是，干預(yù)組中只有一半的裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，且平均肺轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)為5.2±2.5，大部分為Ⅰ期轉(zhuǎn)移灶。
　　結(jié)論：凝血酶通過調(diào)節(jié)骨橋蛋白過表達(dá)肝癌細(xì)胞株的增殖與黏附能力促進(jìn)肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。
　　第四部分凝血酶對整合素受體β1/FAK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響
　　目的：研究凝血酶與骨橋蛋白在肝癌細(xì)胞中的關(guān)系及對整合素受體β1/FAK信號的影響
　　方法：原核表達(dá)骨橋蛋白全長以

20、及凝血酶切片段三株蛋白，觀察三株蛋白在促肝癌細(xì)胞增殖及黏附能力的差別；以凝血酶作用于OPN不同表達(dá)水平的細(xì)胞，western blot研究整合素受體β1/FAK信號通路分子總蛋白以及磷酸化的差異，分析其在肝癌細(xì)胞中對整合素受體β1/FAK信號的影響。
　　結(jié)果：原核重組OPN全長與氨基端片段都能顯著促進(jìn)對數(shù)生長期的增殖能力(P<0.05)，但氨基端片段比全長具有更顯著的促增殖能力(P<0.05)，但是羧基端片段對細(xì)胞增殖并沒有影響

21、。純化好的原核重組OPN全長以及片段包被96孔板，然后比較它們對PLC-CON細(xì)胞不同的黏附能力。與OPN全長相比，氨基端片段顯示出更強(qiáng)的黏附能力(P<0.05)，而羧基端片段與對照BSA相比并沒有顯示出黏附能力。凝血酶作用后，OPN過表達(dá)的細(xì)胞中整合素受體β1 mRNA的表達(dá)水平顯著上升，其下游的FAK磷酸化水平顯著上調(diào)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，在2 U/ml濃度時(shí)FAK的磷酸化達(dá)到峰值，而OPN低表達(dá)的細(xì)胞中不存在這些變化。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)F

22、AK總蛋白表達(dá)水平在兩株細(xì)胞干預(yù)組中發(fā)生改變。而整合素受體β1拮抗性抗體AIIB2(10μg/ml)可以顯著抑制凝血酶引起的FAK磷酸化。
　　結(jié)論：凝血酶通過激活整合素受體β1/FAK信號通路促進(jìn)OPN過表達(dá)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　全文總結(jié)
　　1.凝血酶在肝細(xì)胞肝癌中上調(diào)：
　　2.凝血酶與骨橋蛋白介導(dǎo)的肝細(xì)胞肝癌的惡性表型和不良預(yù)后相關(guān)；
　　3.凝血酶通過激活整合素-β1/FAK通路提高了骨橋蛋白

23、陽性肝癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力。
　　4.凝血酶是干預(yù)骨橋蛋白陽性肝癌患者的潛在的靶點(diǎn)。
　　潛在應(yīng)用價(jià)值
　　1.凝血酶的表達(dá)水平可以預(yù)測肝癌患者的預(yù)后，特別是在骨橋蛋白過表達(dá)的患者中更有意義。
　　2.凝血酶是治療轉(zhuǎn)移性骨橋蛋白過表達(dá)肝細(xì)胞肝癌的治療靶點(diǎn)。
　　3.凝血酶有可能是治療轉(zhuǎn)移性骨橋蛋白過表達(dá)惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.首次報(bào)道了凝血酶的表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌的惡性行為相

24、關(guān)。凝血酶的表達(dá)水平與肝癌患者尤其是骨橋蛋白過表達(dá)患者的轉(zhuǎn)移潛能以及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，并且影響肝癌患者的至復(fù)發(fā)時(shí)間(TTR)和生存。
　　2.首次報(bào)道了凝血酶在骨橋蛋白過表達(dá)肝癌患者預(yù)后判斷的重要作用，并且提供了對這部分患者干預(yù)的重要靶點(diǎn)。體內(nèi)和體外試驗(yàn)表明凝血酶顯著促進(jìn)了骨橋蛋白過表達(dá)肝癌細(xì)胞株的增殖與黏附能力，并且促進(jìn)裸鼠肺轉(zhuǎn)移的能力可被凝血酶抑制劑所阻斷。
　　3.首次報(bào)道了凝血酶可以激活FAK的磷酸化，而這種效應(yīng)可被整合