Th17及CD4+CD25+調節(jié)性T細胞在大鼠肝移植急性排斥及耐受中的作用機制研究.pdf

1、背景：盡管免疫抑制劑的臨床廣泛使用，急性排斥反應(acute rejection，AcR)仍是肝移植早期失敗的主要原因，因此抑制急性排斥并誘導免疫耐受是解決該難題的最佳方案。近年研究表明，肝臟急性排斥反應除與Th1/Th2軸平衡漂移有關外，還和Th17/Treg軸密切相關。因此，調節(jié)Th17向Treg方向偏移，極可能是誘導免疫耐受形成的另一重要機制。目前，Th17/Treg平衡在腎臟、心臟、胰島及皮膚移植等方面報道較多，而在肝移植方面較

2、少，且缺乏對其機制的深入研究。因此，闡明肝移植急性排斥中Th17/Treg軸何時失衡、如何失衡以及其關鍵因子在急性排斥與耐受中充當的角色均具有重要意義。
　　第一部分、近交系大鼠肝移植急性排斥及耐受模型的建立
　　目的:建立近交系大鼠肝移植急性排斥及耐受模型，探討其構建技巧及特點。
　　方法:選擇近交系大鼠LEW和BN為建模對象，采用“改良kamada法”行大鼠原位肝移植，根據供受體不同分為2組:①REJ組(LEW-B

3、N);②TOL組(BN-LEW)。術后觀察兩組受體的一般情況及生存時間，并于術后第1，3，5，7天獲取肝組織及外周血，生化檢測肝功能(ALT、AST、TBIL)動態(tài)變化，HE染色觀察肝臟病理改變并計算排斥活動系數(RAI)。
　　結果:
　　(1) REJ組大鼠術后逐漸出現(xiàn)皮毛粗糙，精神萎靡，活動少，進食少，尿色深黃，而TOL組大鼠的一般情況好，進食較多，尿色正常;前者大鼠均于13內死亡，TOL組大鼠的平均生存時間(59.6

4、7±7.03天)明顯長于REJ組(11.32±0.83天)，兩組的差異明顯(P＜0.05);
　　(2)肝功能結果顯示:術后第1天，兩組的肝功能無明顯差異（P＞0.05）;術后第3天起，REJ組的血清ALT、AST及TBIL增高，于第7天達峰值。而TOL組無明顯變化，兩組比較有顯著差異(P＜0.05);
　　(3)術后3天REJ組肝臟組織出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化:匯管區(qū)見廣泛的炎性浸潤（以淋巴細胞為主，同時伴單核及中性粒細胞），

5、膽管及門靜脈明顯受累;肝小葉結構失常伴肝細胞空泡狀變性，有局灶性出血及壞死;而TOL組組織形態(tài)學無明顯改變。比較兩組排斥活性系數(RAI)，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結論:LEW-BN符合急性排斥反應的典型特點，并于第7天達反應高峰，該模型可以作為研究肝移植急性排斥反應的理想動物模型，而BN-LEW術后未見明顯排斥反應，是免疫耐受組合。
　　第二部分、大鼠肝移植急性排斥與耐受中Th17、 Treg細胞及其相關因子的

6、動態(tài)變化
　　目的:探討Th17細胞及其相關因子（RORγτ、L-17、L-23、IL-6）和Treg細胞及相關因子(FoxP3、IL-10、TGFβ1)在大鼠急性排斥和耐受中的動態(tài)變化及其作用。
　　方法:采用“改良kamada法”行大鼠原位肝移植，分為2組:①REJ組(LEW-BN);②TOL組(BN-LEW)。術后第1，3，5，7天獲取肝組織及外周血，F(xiàn)CM檢測外周血Th17、Treg細胞數量變化，ELISA檢測血清中

7、Th17相關因子(IL-17、IL-23、IL-6)及Treg相關因子(IL-10，TGFβ1)含量，Western blot檢測肝組織中上述細胞因子的蛋白表達，RT-PCR檢測肝組織RORγτ及FoxP3mRNA表達水平。
　　結果:
　　(1) FCM顯示REJ組PBMC中Th17細胞比例增多，Treg細胞比例減少，Th17/Treg明顯失衡;而在TOL組，Th17/Treg比例無顯著變化。
　　(2) RT-PC

8、R表明REJ中RORγt mRNA表達上調，F(xiàn)oxP3mRNA表達下調;而TOL組則呈相反趨勢。兩組比較有明顯的統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　(3) Western blot及ELISA證實急性排斥反應時，肝組織和血清中Th17相關細胞因子(IL-17、IL-23及IL-6)表達上調，而Treg相關細胞因子（IL-10、TGFβ1）表達下調;耐受組中兩者則呈相反趨勢。結論:急性排斥反應時，Th17細胞數量增加，其相關因子（RO

9、Rγτ、IL-17、IL-23、IL-6）表達上調，而Treg細胞減少，其相關因子(FoxP3、IL-10、TGFβ1)表達下調;耐受時則呈相反趨勢。提示Th17/Treg失衡可能導致了急性排斥反應的發(fā)生。
　　第三部分、過繼轉移CD4+CD25+Treg細胞對大鼠肝移植急性排斥反應的影響
　　目的:探討過繼轉移CD4+CD25+Treg細胞對大鼠肝移植急性排斥反應的影響及其機制。
　　方法:分離供體(LEW)脾淋巴細

10、胞靜脈注入受體(BN)，獲得免疫源性后分離BN脾臟單個核細胞(SPMC)，繼以MACS分選出CD4+CD25+Treg，并證實其為活性Treg(CD4+CD25+FoxP3+Treg);以“改良Kamada”法建立大鼠肝移植排斥模型后，隨機分為:過繼轉染組(AT)和非過繼轉染組(NAT)。觀察術后生存率，于術后7d獲取肝臟及血液標本，觀察肝臟組織病理變化，生化檢測血清ALT、AST及TBIL變化，Western Blot檢測肝組織中IL

11、-17、IL-23、IL-10、TGFβ1、IL-4及IFN-γ蛋白表達水平， ELISA檢測血清IL-17、IL-23、IL-10、TGFβ1、IL-4及IFN-γ含量。
　　結果:通過混合淋巴反應及RT-PCR證實了經供體(LEW)脾淋巴細胞刺激分選的受體(BN) CD4+CD25+Treg為具有活性的Treg，即CD4+CD25+FoxP3+Treg。過繼轉移CD4+CD25+Treg后，能減輕AcR，延長受體生存時間;We

12、stern Blot和ELISA檢測結果顯示:AT組IL-17、IL-23表達量低于NAT組(P＜0.05);而IL-10、TGFβ1表達量卻明顯高于NAT組(P＜0.01)。同NAT組中比較，AT組INF-γ、 IL-4均下調，且較其他因子含量低(P＜0.05)，表明過繼轉移CD4+CD25+Treg時，受體鼠體內Th1、Th2型免疫反應均被抑制，可能與Treg直接抑制CD4+/CD8+T淋巴細胞增殖有關。
　　結論:過繼轉移C