VEGF及ICAM-1在糖尿病大鼠內耳的表達及相關性研究.pdf

1、目的：糖尿病內耳微血管病變是糖尿病慢性并發(fā)癥之一，對糖尿病微血管病變的發(fā)生發(fā)展機理研究形成多種學說，主要有非酶糖化學說、多元醇通路學說、甘油二酯、蛋白激酶C系統(tǒng)(Diacylglycerolprotein kinaseC，DAG-PKC system)學說及氧化應激等，目前尚未形成一致的看法。近年來研究發(fā)現炎癥反應過程的異常激活是糖尿病微血管損傷的主要機制，從而引發(fā)糖尿病相關并發(fā)癥的發(fā)生，在炎性反應過程中生成的炎性因子是炎性損傷的關鍵因

2、素，但其導致血管及組織損傷的機制還有待進一步的完善。VEGF亦稱血管通透因子(vascular permeability factor，VPF)，是一組分子量在34000～45000的同源二聚體糖蛋白，是內皮細胞特異性的絲裂原，具有強大的促血管通透能力和促血管生成效應。VEGF可能通過與不同的受體結合，激活不同的信號傳遞系統(tǒng)而發(fā)揮其多樣的生物學功能。VEGF主要的生物學功能如促血管內皮細胞增生、遷移，促血管生成和增加血管通透性作用。細胞

3、間粘附分子-1(ICAM-1)是在細胞表面表達的具有介導細胞間或細胞與細胞外基質相互作用的糖蛋白，它通過與其受體結合，介導細胞間黏附，并相互傳遞信號，參與調控細胞功能，在機體的胚胎發(fā)育，正常組織結構的維持，炎癥與免疫應答，傷口修復，凝血與血栓形成，腫瘤的浸潤與轉移等多種病理生理過程中均有重要的作用。在內耳的炎癥反應及自身免疫反應過程中，在多種因子的刺激下細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達增高，可誘導單核巨噬細胞粘附于血管內皮細胞并穿

4、越血管壁游走到特定的炎性反應部位。故研究血管內皮生長因子(VEGF)及細胞間粘附分子-1(ICAM-1)在糖尿病內耳微血管病變中的表達及相關性，有助于探討糖尿病耳聾的發(fā)病機制，并為臨床預防及延緩糖尿病耳聾的發(fā)生提供理論依據。
　　 方法：采用血管內皮細胞生長因子及血管內皮細胞生長因子的免疫組織化學檢查及耳蝸毛細血管壁厚度的光鏡觀察，來分析VEGF及ICAM-1在糖尿病內耳微血管病變中表達及其相關性。具體步驟如下：(1)動物的選擇

5、及處理：選擇白色雌性健康的wister大鼠48只(河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，月齡2.5-3個月，體重180～220g；必須耳廓反射靈敏、耳鏡觀察鼓膜完整。按原始體重由小至大編號后，隨機分為兩組，一組為對照組(CG)以普通飼料喂養(yǎng)，二組為糖尿病組(DM)以高脂、高糖飼料喂養(yǎng)，以鏈尿佐菌素(STZ)65mg/kg腹腔注射，造糖尿病模型，注藥后動物空腹血糖>16.65 mmol/L為造模成功。對照組大鼠一次性腹腔注射等體積不含STZ的0

6、.1mol/L檸檬酸緩沖液作為對照，以后以普通飼料喂養(yǎng)。以造模成功開始計時，將糖尿病組大鼠隨機分為糖尿病0周(DM0)、糖尿病4周(DM4)、糖尿病8周(DM8)、糖尿病12周(DM12)及正常組分為正常組0周(CG0)、正常組4周(CG4)、正常組8周(C68)、正常組12周(CG12)，分別于0周、4周、8周、12周時取糖尿病組(DM)及對照組(CG)6只大鼠行全麻后取出耳蝸放入4％多聚甲醛中固定，4度冰箱保存?zhèn)溆谩?2)免疫組織化

7、學實驗：取每只老鼠的雙耳于EDTA液中脫鈣10天后，梯度酒精脫水行石蠟包埋，超薄切片機切片后行免疫組化實驗，具體步驟按照試劑盒進行。(3)光鏡觀察。(4)數據統(tǒng)計分析。
　　 結果：
　　 1、大鼠一般情況：對照組大鼠一般情況良好，活動自如，進食及飲水情況無明顯變化，體重持續(xù)增加；糖尿病組大鼠出現進食增加、飲水增加、排泄增多、體重下降等典型的糖尿病表現。經反復測試，對照組血糖均穩(wěn)定在正常范圍，糖尿病組血糖有明顯升高，說明

8、造模成功。
　　 2、血管壁厚度的改變：對兩組大鼠在各個時期的毛細血管壁厚度進行測量，結果以x±s表示，正常組0周時血管壁厚度平均0.094μ m±0.022μ m，4周時平均為0.097μ m±0.021μ m，8周時平均為0.10μm±0.01μm，12周時平均為0.189μm±0.03μ m，而糖尿病組血管壁明顯增厚，糖尿病組0周時平均血管壁厚度為0.11μ m±0.01μ m，4周時平均為0.145μ m±0.023μ

9、mμ m，8周時平均為0.176μ m±0.03μ m，12周時平均為0.189μ m±0.03μ m，經統(tǒng)計學分析，兩組血管壁厚度比較有顯著性差異(P<0.05)，即糖尿病組血管壁厚度高于正常組，且隨病程的延長血管壁厚度逐漸增加。
　　 3、血管內皮細胞生長因子的表達，對照組，VEGF在血管紋、螺旋韌帶、螺旋器、螺旋軸及螺旋神經節(jié)細胞有微弱的表達。在糖尿病組大鼠VEGF在血管紋、螺旋韌帶、螺旋神經節(jié)細胞的表達明顯的增強，且隨病

10、程的延長表達輕度逐漸增加，主要在胞漿表達。糖尿病組和正常組之間表達比較(P<0.05)，差異有顯著性。VEGF表達與血管壁厚做相關性分析，兩者之間呈正相關(r=0.759，19<0.01)。
　　 4、細胞間粘附分子-1的表達：正常組ICAM-1的表達為弱陽性，主要表達部位有螺旋韌帶及外淋巴區(qū)間皮有弱(+)ICAM-1的染色。糖尿病組ICAM-1的表達為隨病程的延長表達部位增多且陽性越來越強，表現為弱陽性、陽性、強陽性，主要表達

11、部位有螺旋軸靜脈及其回流的小靜脈、螺旋韌帶，尤其螺旋軸靜脈及其回流的小靜脈的染色較強。主要在胞漿表達。糖尿病組和正常組之間有差異(P<0.05)，與血管壁厚度做相關性分析，兩者之間有相關性，(R=0.729，P<0.01)。
　　 結論
　　 1、以STZ55mg/kg一次性腹腔注射給雌性wister大鼠成功的建立了類似人類2型糖尿病的大鼠模型；
　　 2、糖尿病大鼠內耳中的微血管病變，包括毛細血管基底膜增厚；<