番荔枝酰胺衍生物(FLZ)選擇性抑制γ-分泌酶改善線粒體功能及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、淀粉樣前體蛋白(APP)的代謝是阿爾茲海默癥(AD)發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一般認(rèn)為，APP經(jīng)蛋白酶剪切形成淀粉樣蛋白(Aβ)的過程與AD發(fā)病密切相關(guān)。但Aβ導(dǎo)致AD的具體機(jī)制還并不清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ可能通過引起線粒體的功能紊亂而造成神經(jīng)元的損傷，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生發(fā)展。線粒體上的Aβ可以由線粒體上的APP局部代謝產(chǎn)生，也可以攝取自線粒體外。蓄積于線粒體的Aβ直接降低線粒體呼吸鏈上的細(xì)胞色素c氧化酶(COXIV)的水平與活性，損傷

2、呼吸鏈的電子傳遞功能，增加活性氧(ROS)的產(chǎn)生，同時(shí)減少ATP的生成。由此引起的線粒體功能紊亂將在多個(gè)方面影響神經(jīng)元的功能狀態(tài)。阻斷Aβ對線粒體功能的損傷，從而恢復(fù)線粒體的功能，可能有助于緩解或逆轉(zhuǎn)AD的病理過程。
　　 芬樂胺(FLZ)是全合成的番荔枝酰胺衍生物。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究FLZ的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，分為三個(gè)部分。第一部分研究FLZ對線粒體上APP代謝過程的影響，由此產(chǎn)生的線粒體保護(hù)作用以及作用機(jī)制；第二部

3、分研究FLZ對γ-分泌酶的選擇性抑制作用；第三部分對由APPSwe造成的線粒體功能障礙對腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響進(jìn)行了初步研究。
　　 第一部分FLZ對線粒體上APP代謝過程影響的研究是在穩(wěn)定過表達(dá)APP695(wt/Swe)的SH-SY5Y細(xì)胞(APP-SH-SY5Y)中進(jìn)行的。FLZ可減緩APP在線粒體上的代謝，并減少線粒體上Aβ的生成。同時(shí)，F(xiàn)LZ改善線粒體功能，上調(diào)COXIV的蛋白水平和活性，增加

4、ATP的生成。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LZ降低γ-分泌酶活性中心早老素(PS)成熟的C端片段水平。FLZ可能通過抑制參與APP代謝的γ-分泌酶來減緩APP在線粒體上的代謝。
　　 在APP-SH-SY5Y細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LZ對γ-分泌酶活性的抑制不同于γ-分泌酶活性的非選擇性抑制劑DAPT，并沒有減少Notch信號的胞內(nèi)段(NICD)的產(chǎn)生。γ-分泌酶存在多種代謝底物，APP和Notch信號相關(guān)蛋白是其最主要的代表。選擇性抑制γ-分

5、泌酶的活性是抗AD藥物研發(fā)中面臨的一大挑戰(zhàn)。
　　 為了進(jìn)一步研究FLZ對γ-分泌酶抑制的機(jī)制，在第二部分的研究中使用APP的C端片段重組蛋白和NICD重組蛋白構(gòu)建了γ-分泌酶活性檢測平臺。在體外γ-分泌酶活性檢測體系中，F(xiàn)LZ劑量依賴性地抑制了APP的C端重組蛋白片段的代謝，而對NICD的代謝沒有明顯的劑量依賴性作用。DAPT對APP的C端重組蛋白和NICD重組蛋白代謝均呈明顯的劑量依賴性抑制。上述研究結(jié)果提示FLZ是一種不同

6、于DAPT的γ-分泌酶選擇性抑制劑，可能通過選擇性地抑制γ-分泌酶來減少線粒體上Aβ的蓄積。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LZ能夠上調(diào)AD疾病模型中BDNF相關(guān)的信號活動。BDNF與神經(jīng)元軸突末端的TrkB受體結(jié)合，內(nèi)化后通過軸突逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。神經(jīng)元的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)于線粒體的功能狀態(tài)密切相關(guān)。因此，本課題第三部分對APPSwe相關(guān)的BDNF軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙進(jìn)行了的初步研究，考察線粒體的功能改善是否會促進(jìn)BDN

7、F的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)。這部分研究使用慢病毒在原代海馬細(xì)胞導(dǎo)入APPSwe，并重組表達(dá)帶熒光標(biāo)簽的BDNF。感染了APPSwe慢病毒的原代海馬細(xì)胞中，BDNF的進(jìn)入量明顯減少，同時(shí)線粒體分布面積減少，聚集于神經(jīng)元胞體的細(xì)胞核周圍。APPSwe可能通過損傷線粒體的功能，從而影響了神經(jīng)元中BDNF的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 本課題的研究認(rèn)為FLZ是一種有潛力的抗AD候選化合物，其機(jī)制可能是通過選擇性地抑制γ-分泌酶從而減少線粒體上Aβ的生成，減少RO

8、S，增加ATP的產(chǎn)生，改善線粒體的功能狀態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。此外，在APPSwe相關(guān)的BDNF軸突轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的初步研究中發(fā)現(xiàn)，APPSwe減弱了BDNF的軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，其機(jī)制可能是損傷了線粒體的功能。
　　 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)如下：
　　 1．建立了檢測線粒體上Aβ的方法，使得對APP的線粒體代謝研究和Aβ的線粒體損傷研究更為深入；
　　 2．建立了γ-分泌酶活性檢測平臺，有利于評價(jià)化合物對γ-分泌酶的選擇性抑制作用；