MUC2基因表達(dá)與益生菌抑制大腸桿菌K1株黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的關(guān)系研究.pdf

1、一、研究背景
　　 黏蛋白(Mucin)是由體內(nèi)多種上皮細(xì)胞分泌的大分子量糖蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同可分為分泌型和膜結(jié)合型。在正常情況下，黏蛋白除了對(duì)上皮細(xì)胞組織起保護(hù)作用外，還參與上皮細(xì)胞的分類(lèi)和更新，細(xì)胞黏附和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)等。在病理狀態(tài)下，黏蛋白在惡性腫瘤及癌病變中的表達(dá)發(fā)生異常。MUC2屬于分泌型黏蛋白，在結(jié)腸、小腸及呼吸道上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。該蛋白質(zhì)在腸道的表面形成一層粘液層發(fā)揮潤(rùn)滑和拮抗致病菌的腸道黏附和侵襲的

2、作用。在正常情況下，MUC2100％表達(dá)于腸道粘膜上皮，而在大腸腫瘤中表達(dá)降低。目前已在多種上皮來(lái)源的腫瘤及腸道疾病中發(fā)現(xiàn)黏蛋白的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，出現(xiàn)黏蛋白的異常表達(dá)，其異常表達(dá)與臨床預(yù)后相關(guān)。Ho等研究顯示MUC2的異常表達(dá)與其啟動(dòng)子高甲基化相關(guān)，并且已有研究顯示在結(jié)直腸癌細(xì)胞中MUC2 mRNA的表達(dá)受抑制，其發(fā)生機(jī)制與MUC2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化相關(guān)。
　　 細(xì)菌性腦膜炎是新生兒時(shí)期中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)最嚴(yán)重的感

3、染。其中大腸埃希菌(E.coli)K1株是目前新生兒細(xì)菌性腦膜炎的首要致病菌。E.coli K1株在40％敗血癥或80％腦膜炎患兒中都可分離到，它主要源于母親腸道，孕婦因其特殊體質(zhì)，腸道定殖的E.coli K1株容易易位于陰道，致使新生兒在通過(guò)產(chǎn)道時(shí)獲得感染。E.coli K1株一旦定植于新生兒腸道，0.5％可發(fā)生腸道侵襲性定位轉(zhuǎn)移而入血，并穿過(guò)血腦屏障而引發(fā)腦膜炎。所以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，抑制致病菌的腸道黏附侵襲，成為在孕婦階段預(yù)防本

4、病發(fā)生的關(guān)鍵步驟。另外，新生兒腦膜炎的發(fā)生過(guò)程中，E.coli K1株首先定植于新生兒腸道，之后才會(huì)穿透腸屏障和血腦屏障，引起菌血癥和腦膜炎，所以預(yù)防E.coli K1株株穿透腸上皮入血，也成為有效預(yù)防其引發(fā)菌血癥和腦膜炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？股貜V泛應(yīng)用于感染性疾病的治療，細(xì)菌性腦膜炎仍然是新生兒高發(fā)病率和高死亡率的重要原因之一。各種抗生素的廣泛長(zhǎng)期應(yīng)用，一方面使耐藥菌株增加，耐藥因子迅速擴(kuò)散，另一方面引起腸道菌群絮亂，造成腸道功能失調(diào)。

5、r>　　 益生菌是一類(lèi)對(duì)宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱(chēng)。益生菌對(duì)維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定、降低胃腸道疾病的發(fā)病率、抑制病原微生物侵襲、對(duì)腹瀉疾病的預(yù)防、調(diào)節(jié)免疫防御方面有重要作用。體外研究證實(shí)，益生菌制劑抑制病原微生物黏附腸道上皮細(xì)胞，抑制作用是通過(guò)增加腸道黏液素MUC2、MUC3的表達(dá)為媒介。細(xì)菌上皮細(xì)胞黏附是多步驟的，首先是細(xì)菌與上皮細(xì)胞層

6、的作用。益生菌通過(guò)加強(qiáng)腸內(nèi)黏液素的產(chǎn)生來(lái)阻止腸道病原菌的附著，附著能被抑制是空間障礙或者黏液素模仿上皮細(xì)胞的細(xì)菌結(jié)合位點(diǎn)而產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)抑制。R.Mack等證實(shí)黏蛋白由腸上皮細(xì)胞分泌，阻擋致病蛋白EPEC接觸腸上皮細(xì)胞，避免EPEC黏附到腸上皮細(xì)胞。腸道黏液層的主要成分黏蛋白是一種高分子量的糖蛋白通過(guò)上皮細(xì)胞的許多器官合成和分泌的，其有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)腸道和預(yù)防致病菌損傷的作用。在不同黏蛋白基因中，MUC2是主要的回結(jié)腸黏蛋白，在小腸和大腸的

7、杯狀細(xì)胞中表達(dá)，是結(jié)腸的主要分泌黏蛋白成分。腸道病原菌擁有了很多戰(zhàn)略來(lái)回避黏蛋白疊加上皮細(xì)胞。黏蛋白-病原體相互作用可能由上皮細(xì)胞黏蛋白的數(shù)量和質(zhì)量決定的。
　　 目前對(duì)益生菌、致病菌和腸道黏蛋白基因表達(dá)之間的關(guān)系研究較少。MUC2在致病菌侵襲腸屏障中的作用機(jī)理仍不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建MUC2 shRNA真核質(zhì)粒表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞干擾MUC2基因表達(dá)，以了解黏蛋

8、白MUC2基因沉默與E.coli K1株E44黏附侵襲腸屏障之間的關(guān)系;另一方面，通過(guò)去甲基化制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)預(yù)先處理Caco-2細(xì)胞，探討去甲基化制劑5-Aza-CdR誘導(dǎo)高甲基化失活的MUC2基因重新表達(dá)的可能性及其對(duì)大腸桿菌E44株黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的影響，初步鑒定5-Aza-CdR與益生菌之間的作用關(guān)系，以了解益生菌和5-Aza-CdR在E.coli K1株E44侵襲腸屏障中的具體機(jī)制，為研究MU

9、C2基因在益生菌拮抗致病菌黏附侵襲腸上皮細(xì)胞中的作用及機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　 二、研究方法
　　 1、MUC2 shRNA真核質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定為了探討?zhàn)さ鞍譓UC2基因沉默與三聯(lián)活菌片中益生菌抑制大腸桿菌K1株E44黏附侵襲腸上皮作用之間的關(guān)系，設(shè)計(jì)合成4個(gè)靶向MUC2基因的可干擾序列，并設(shè)計(jì)一條經(jīng)BLAST檢索與現(xiàn)有基因文庫(kù)中所有人源基因均無(wú)同源性的非特異性序列為陰性對(duì)照序列。將合成的DNA Oligo稀釋后退火

10、形成shRNA雙鏈DNA，與pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒分別用Bbs I、BamH I雙酶切后，以T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。
　　 2、重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌Caeo-2細(xì)胞取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒1.6μg和4.0μL脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別稀釋于100μL Opti-MEM中，室溫靜置5min;然后將兩者混合，室溫再放置20

11、min，均勻加入培養(yǎng)孔內(nèi)6h后，更換含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的綠色熒光情況，預(yù)測(cè)重組干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞的效率。
　　 3、熒光定量PCR檢測(cè)MUC2基因干擾效率并篩選最有效的干擾序列細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，Trizol法抽提細(xì)胞總RNA。取2μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算MUC2基因的相對(duì)表達(dá)量，以C

12、aco-2細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞。根據(jù)熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，篩選出最有效抑制MUC2基因表達(dá)的干擾質(zhì)粒并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 4、MUC2基因干擾后競(jìng)爭(zhēng)性排斥法檢測(cè)益生菌對(duì)E.coli K1株黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的影響?zhàn)じ胶颓忠u實(shí)驗(yàn)采用競(jìng)爭(zhēng)性排除法，將人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株接種于24孔板中，細(xì)胞密度達(dá)80％～90％，用滅菌的PBS漂洗2次。黏附侵襲實(shí)驗(yàn)步驟如前研究所述:每孔加108 CFU益生菌與107 CFU E44株共同孵

13、育2.5h，對(duì)照組用等體積培養(yǎng)基代替益生菌與等量致病菌共同孵育。用培養(yǎng)基輕輕漂洗細(xì)胞3次，黏附實(shí)驗(yàn)每孔加0.5％ TritonX-100200μL，孵育8min裂解細(xì)胞，加入蒸餾水250μL，連續(xù)多次吹打并吸出樣品，倍比稀釋后涂布含利福平的瓊脂平板24h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。侵襲實(shí)驗(yàn)先用培養(yǎng)基(含慶大霉素終濃度為100μg/mL)孵育1h，以殺死細(xì)胞外細(xì)菌，之后實(shí)驗(yàn)步驟按照黏附實(shí)驗(yàn)的操作步驟，倍比稀釋后涂布含利福平的瓊脂平板24h

14、后計(jì)數(shù)菌落數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　 5、去甲基化制劑5-Aza-CdR處理Caco-2細(xì)胞后MUC2基因的表達(dá)情況去甲基化制劑5-Aza-CdR作用Caco-2細(xì)胞72h后，不同處理組細(xì)胞分別與益生菌、大腸桿菌E44孵育。收集各組不同處理的Caco-2細(xì)胞，用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，該實(shí)驗(yàn)操作按照Invitrogen/Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。紫外分光光度儀測(cè)定純度，A260/A280比值在1.80～1.90之

15、間。取2μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參。每組重復(fù)3次，通過(guò)2-ΔΔCt表示MUC2的相對(duì)表達(dá)量，以Caco-2細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞。
　　 6、競(jìng)爭(zhēng)性排斥方法檢測(cè)去甲基化制劑5-Aza-CdR對(duì)大腸桿菌E44黏附侵襲腸上皮的影響實(shí)驗(yàn)采用競(jìng)爭(zhēng)性排除法，將人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞株接種于24孔板中，細(xì)胞密度達(dá)70％～80％，將去甲基化制劑5-Aza-CdR按5×10-6mol/L的濃度配制的培養(yǎng)液加到

16、5-Aza-CdR+E44組、5-Aza-CdR+益生菌+E44組相應(yīng)培養(yǎng)孔中，分別在24h及48h后更換相同濃度的5-Aza-CdR培養(yǎng)液。以未加5-Aza-CdR干預(yù)的細(xì)胞為對(duì)照組，用等體積培養(yǎng)基代替5-Aza-CdR培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔。用滅菌的PBS漂洗2次。黏附實(shí)驗(yàn):每孔加108 CFU益生菌與107 CFU E44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組中共同孵育2.5h，其他組用等體積培養(yǎng)基代替與等量致病

17、菌共同孵育。侵襲實(shí)驗(yàn):每孔加108 CFU的益生菌與107CFU E44株到5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組中共同孵育2.5h，其他組用等體積培養(yǎng)基代替與等量致病菌共同孵育。黏附侵襲實(shí)驗(yàn)步驟如前研究所述。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 三、結(jié)果
　　 1、重組真核質(zhì)粒表達(dá)載體酶切鑒定和DNA測(cè)序結(jié)果挑選單克隆菌株，接種到含50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，震蕩過(guò)夜，按質(zhì)粒小量抽提步驟抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用B

18、amH I、Pst1分別酶切鑒定。陽(yáng)性重組質(zhì)粒應(yīng)該可以被BamH I切開(kāi)，而不能被Pst I切開(kāi)。單酶切結(jié)果顯示，所有重組體均為陽(yáng)性重組質(zhì)粒，從每組平板中挑選兩個(gè)典型克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。經(jīng)引物測(cè)序后，測(cè)序結(jié)果和設(shè)計(jì)的shRNA堿基序列完全一致，證明該退火后合成的片段已經(jīng)完整的插入了質(zhì)粒之中而且沒(méi)有單個(gè)堿基的突變，成功的構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)所需要的重組質(zhì)粒。
　　 2、脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞并間接估計(jì)轉(zhuǎn)染效率脂質(zhì)體法RNAi MUC

19、2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞24h后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光數(shù)，通過(guò)計(jì)數(shù)同一視野光鏡下細(xì)胞總數(shù)及熒光顯微鏡下帶有綠色熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算帶有綠色熒光細(xì)胞的百分比，即轉(zhuǎn)染效率=（綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100％。本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率約為75％～85％。
　　 3、MUC2基因mRNA表達(dá)的變化重組質(zhì)粒(RNAi MUC2)轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞48h后，提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行檢測(cè)，其對(duì)Caco-2細(xì)胞中MUC2 mRNA的抑制情況如RT-

20、qPCR結(jié)果顯示。通過(guò)相對(duì)定量方法2-ΔΔCt來(lái)檢測(cè)MUC2基因的干擾效率。
　　 在設(shè)置的六組試驗(yàn)中，RNAi MUC2-1～4實(shí)驗(yàn)組的MUC2基因相對(duì)表達(dá)率分別為0.38、0.59、1.08、0.46，與空白組(Mock Control)比較，RNAi MUC2-1、RNAiMUC2-4有顯著差異，其干擾效率為62％和54％;陰性對(duì)照組RNAi NC的MUC2基因相對(duì)表達(dá)率與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在以后的實(shí)驗(yàn)中將選用R

21、NAiMUC2-1質(zhì)粒進(jìn)行靶向MUC2基因功能抑制。
　　 4、MUC2基因沉默后，益生菌對(duì)大腸桿菌E44黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的抑制作用采用競(jìng)爭(zhēng)排斥實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)MUC2基因干擾前后益生菌干擾E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的效果。以干擾前E44黏附侵襲率作為100％，以此標(biāo)化益生菌共同孵育時(shí)E44的相對(duì)黏附侵襲率，MUC2基因干擾前，益生菌明顯抑制致病菌黏附侵襲Caco-2細(xì)胞（P＜0.01），E44相對(duì)黏附率為14.36％，E4

22、4相對(duì)侵襲率為22.55％;MUC2基因干擾后，加益生菌共同孵育組與E44組相比，E44對(duì)腸上皮的黏附侵襲作用明顯提高，E44相對(duì)粘附率為63.64％，E44相對(duì)侵襲率為70.33％。細(xì)菌黏附侵襲實(shí)驗(yàn)證明干擾MUC2基因后益生菌抑制E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的作用顯著降低(P＜0.01)。
　　 5、去甲基化制劑5-Aza-CdR處理前后MUC2基因mRNA的表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞經(jīng)5×10-6mol/L5-Aza

23、-CdR處理后，MUC2基因的mRNA重新表達(dá)（P＜0.01），結(jié)果與益生菌組一致，E44組MUC2基因表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P＜0.01），而5-Aza-CdR+E44組、5-Aza-CdR+益生菌+E44組、益生菌+E44組與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異。
　　 6、去甲基化制劑5-Aza-CdR對(duì)大腸桿菌E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的影響加去甲基化制劑5-Aza-CdR處理Caco-2細(xì)胞72h后，采用競(jìng)爭(zhēng)性排斥法將益生菌、大

24、腸桿菌E44株與Caco-2細(xì)胞共孵育，檢測(cè)去甲基化制劑5-Aza-CdR和益生菌拮抗大腸桿菌E44株黏附侵襲Caco-2細(xì)胞的效果。以對(duì)照組E44黏附侵襲率作為100％，以此標(biāo)化5-Aza-CdR處理組和益生菌共同孵育組E44的相對(duì)黏附侵襲率，加去甲基化制劑5-Aza-CdR處理后，明顯降低致病菌E44黏附侵襲Caco-2細(xì)胞（P＜0.05），E44相對(duì)黏附率為10.33％，E44相對(duì)侵襲率為29.45％;益生菌作用效果與5-Aza-

25、CdR相似，與對(duì)照組相比，益生菌組E44相對(duì)黏附率為11.70％，相對(duì)侵襲率為33.43(P＜0.05)。
　　 四、結(jié)論
　　 1、shRNA真核質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾可明顯抑制Caco-2細(xì)胞MUC2基因的表達(dá);
　　 2、MUC2基因沉默后，益生菌對(duì)E44黏附侵襲腸上皮細(xì)胞的抑制作用明顯降低;
　　 3、去甲基化制劑5-Aza-CdR能夠逆轉(zhuǎn)MUC2基因甲基化狀態(tài)，調(diào)控MUC2基因重新表達(dá);