COX-2-PGE2途徑介導LPS對人肝內(nèi)膽管上皮細胞MUC2和MUC5AC的誘導作用.pdf

1、前言：
　　肝內(nèi)膽管結(jié)石是一種主要發(fā)生于東亞的地區(qū)性疾病，其發(fā)病機制仍沒有完全研究清楚。既往研究顯示慢性增生性膽管炎癥是肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病因素之一。在炎癥過程中，一系列炎癥介質(zhì)的釋放可能是肝內(nèi)膽管結(jié)石發(fā)病的重要機制。動物實驗中發(fā)現(xiàn)外源性PGE2能夠引起肝內(nèi)膽管出現(xiàn)類似于膽管炎樣的形態(tài)改變。而伴有肝內(nèi)膽管結(jié)石的膽管上皮表達更多的COX-2和PGE2。此外，研究發(fā)現(xiàn)PGE2能夠促進膽管上皮細胞增殖。這些研究提示COX-2/PGE2過度

2、表達參與了慢性增生性膽管炎及肝內(nèi)結(jié)石的發(fā)病過程。
　　慢性增生性膽管炎引起肝內(nèi)結(jié)石的重要原因之一為MUC（粘蛋白的蛋白部分）的過度分泌。研究顯示含結(jié)石的肝內(nèi)膽管上皮MUC2和MUC5AC表達顯著高于正常肝內(nèi)膽管上皮，提示MUC2和MUC5AC參與了肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成過程。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)慢性增生性膽管炎伴有肝內(nèi)膽管結(jié)石患者膽汁中含有高水平的磷脂酶A2，同時伴隨LPS、PGE2及MUC2和MUC5AC表達增多。綜合以上研究結(jié)果，我

3、們推測在慢性增生性膽管炎中，COX-2/PGE2可能介導了MUC2和MUC5AC過度分泌，并促進了肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病過程。
　　在本實驗中，我們將首次采用體外培養(yǎng)的人類肝內(nèi)膽管上皮細胞作為研究對象，以LPS作為刺激因素，觀察研究COX-2/PGE2在肝內(nèi)膽管上皮細胞的表達情況，同時檢測MUC2和MUC5AC的表達狀態(tài)。采用COX-2抑制劑及外源性PGE2處理等手段探討COX-2/PGE2是否介導了MUC2和MUC5AC的表達上調(diào)過

4、程，并對其中的信號轉(zhuǎn)導機制進行研究和探索。
　　材料和方法：
　　人肝內(nèi)膽管上皮細胞HIBEC(Human Intrahepatic Biliary Epithelial Cells)及培養(yǎng)液購于美國ScienCell公司;COX-2多克隆抗體購自于武漢博士得公司;TLR4、NFκBp65、EP4多克隆抗體及MUC2、MUC5AC單克隆抗體購自于Santa Cruz公司（美國）;PGE2 ELISA試劑盒購自于Biotrak

5、 Amersham公司（英國）;RNAisoReagent和SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit購自于大連寶生物工程公司; TLR4拮抗劑E5564購自美國EB16-Science公司;內(nèi)毒素、NFκB抑制劑PDTC、EP4抑制劑AH23848、 COX-2抑制劑NS-398和PGE2購自于美國Sigma公司。
　　CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司;LightCycler PCR儀，瑞士Roche Diagn

6、otics公司;全自動酶標儀ST-360，日本KHB公司;5810R低溫超速離心機，德國EFFENDORF公司;凝膠自動成像分析系統(tǒng)，美國PERSONALFX公司;UVMINI-1204紫外分光光度計，日本島津公司;MDF-U32V深凍冰箱，日本Sanyo公司等。
　　采用RNAiso reagent進行RNA提取;RNA檢測采用real-time PCR技術;蛋白檢測采用Western blot技術;細胞上清液中蛋白檢測采用El

7、isa法。
　　兩者比較采用student'st檢驗，不同時間點比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有顯著性差異。采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學處理。
　　結(jié)果：
　　1、COX-2和PGE2在人肝內(nèi)膽管上皮細胞中的表達及LPS對其表達的誘導作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細胞內(nèi)存在較弱的COX-2蛋白表達。在經(jīng)LPS作用后，COX-2蛋白和mRNA表達均顯著增加(P＜0.01)，其中在6小時后增加最為顯著，CO

8、X-2mRNA表達水平增加到基礎表達的24.6倍。人肝內(nèi)膽管上皮細胞經(jīng)LPS(1μg/ml)作用后，細胞上清液中PGE2含量顯著增加（P＜0.01）。
　　2、LPS受體TLR4介導LPS對COX-2/PGE2表達的誘導作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細胞存在TLR4蛋白和mRNA表達，經(jīng)LPS作用后，TLR4蛋白和mRNA表達水平均升高，其中TLR4 mRNA表達水平升高了3.6倍(P＜0.01)。經(jīng)TLR4拮抗劑E5564預處

9、理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細胞。COX-2 mRNA表達未出現(xiàn)顯著增加。同時，細胞上清液中PGE2含量亦未出現(xiàn)顯著升高。結(jié)果顯示LPS對COX-2和PGE2的誘導作用被TLR4拮抗劑E5564抑制。
　　3、核轉(zhuǎn)錄因子NFκB介導LPS對COX-2/PGE2表達的誘導作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細胞核內(nèi)存在NFκBp65表達，經(jīng)LPS作用后，NFκBp65表達水平升高。結(jié)果顯示LPS能夠促進NFκBp65向核內(nèi)移位

10、。經(jīng)NFκB抑制劑PDTC預處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細胞。COX-2 mRNA表達未出現(xiàn)顯著增加。同時，細胞上清液中PGE2含量亦未出現(xiàn)顯著升高。結(jié)果顯示LPS對COX-2和PGE2的誘導作用被NFκB抑制劑PDTC阻斷。
　　4、MUC2在人肝內(nèi)膽管上皮細胞中的表達及LPS對其表達的誘導作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細胞內(nèi)存在較弱的MUC2蛋白表達。在經(jīng)LPS作用后，MUC2蛋白和mRNA表達均顯著增加(P＜0

11、.01)，其中在12小時后增加最為顯著，MUC2mRNA表達水平增加到基礎表達的15.5倍。
　　5、MUC5AC在人肝內(nèi)膽管上皮細胞中的表達及LPS對其表達的誘導作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細胞內(nèi)存在MUC5AC蛋白表達。在經(jīng)LPS作用后，MUC5AC蛋白和mRNA表達均顯著增加(P＜0.01)，其中在12小時后增加最為顯著，MUC5AC mRNA表達水平增加到基礎表達的26.2倍。
　　6、LPS受體TLR4介導LP

12、S對MUC2和MUC5AC表達的誘導作用。
　　經(jīng)TLR4拮抗劑E5564預處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細胞。MUC2 mRNA及MUC5AC mRNA表達均未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表達的誘導作用被TLR4拮抗劑E5564抑制。
　　7、核轉(zhuǎn)錄因子NFκB介導LPS對MUC2和MUC5AC表達的誘導作用。
　　經(jīng)NFκB抑制劑PDTC預處理后，然后采用LPS作

13、用人肝內(nèi)膽管上皮細胞。MUC2 mRNA及MUC5AC mRNA表達均未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表達的誘導作用被NFκB抑制劑PDTC阻斷。
　　8、 PGE2受體EP4在人肝內(nèi)膽管上皮細胞中的表達及LPS對其表達的誘導作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細胞內(nèi)存在EP4蛋白和mRNA表達，經(jīng)LPS作用后，EP4蛋白和mRNA表達水平均升高，其中EP4 mRNA表達水平升高了5.2倍(P＜

14、0.01)。經(jīng)EP4抑制劑AH23848預處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細胞。MUC2mRNA及MUC5AC mRNA表達均未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2 mRNA和MUC5AC mRNA表達的誘導作用被EP4抑制劑AH23848阻斷。
　　9、COX-2抑制劑抑制LPS對MUC2和MUC5AC表達的誘導作用。
　　經(jīng)COX-2抑制劑NS-398預處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細胞。MUC2 m

15、RNA及MUC5AC mRNA表達未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表達的誘導作用可被COX-2抑制劑NS-398抑制。
　　10、外源性PGE2誘導細胞MUC2和MUC5AC的表達。
　　采用外源性PGE2作用人肝內(nèi)膽管上皮細胞，MUC2蛋白和mRNA表達顯著升高，其mRNA表達升高17.3倍(P＜0.01)。同時，MUC5AC蛋白和mRNA表達亦顯著升高，其mRNA表達升高了21.4

16、倍(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、LPS可上調(diào)人肝內(nèi)膽管上皮細胞COX-2/PGE2表達，提示COX-2/PGE2途徑參與了人肝內(nèi)膽管炎癥過程。LPS受體TLR4及NFκB介導了LPS對人肝內(nèi)膽管上皮細胞COX-2/PGE2表達的調(diào)節(jié)過程。
　　2、LPS可誘導人肝內(nèi)膽管上皮細胞表達MUC2和MUC5AC，提示肝內(nèi)膽管炎癥能引起MUC2和MUC5AC分泌增多。LPS受體TLR4及NFκB參與了LPS對人肝內(nèi)膽管