骨關節(jié)系統(tǒng)內(nèi)溶質(zhì)輸運和關節(jié)軟骨胞內(nèi)鈣響應的原位示蹤研究.pdf

1、骨與軟骨是保證身體運動和提供機械支撐的主要部分。與其他組織器官相同，骨與軟骨處于一個動態(tài)三維環(huán)境內(nèi)；其內(nèi)部的流體及溶質(zhì)輸運對維持組織本身的功能及自身活性是必不可少的。本研究從骨內(nèi)、骨與軟骨間的物質(zhì)輸運和關節(jié)軟骨胞內(nèi)鈣響應三個方面開展工作，嘗試能更好的理解物質(zhì)輸運在骨關節(jié)系統(tǒng)內(nèi)的作用。
　　本研究第一部分主要就機械載荷條件和不同生理病理環(huán)境對骨的骨陷窩-骨小管系統(tǒng)（LCS）內(nèi)溶質(zhì)輸運的影響進行量化研究。LCS系統(tǒng)主要由骨細胞外未鈣化

2、的胞周基質(zhì)（PCM）構成。采用本課題組開發(fā)的熒光光漂白恢復技術（FRAP）與單軸加載整合加載-成像系統(tǒng)和相應數(shù)學模型，在前期實驗研究驗證的機械加載強化微流體環(huán)境的溶質(zhì)對流的基礎上，本研究就不同機械載荷條件（強度、頻率）和生理病理條件（彌散性微損傷骨片、基底膜蛋白聚糖缺失基因型小鼠）下骨的LCS系統(tǒng)內(nèi)溶質(zhì)輸運的量化研究，進而探討LCS微流體環(huán)境內(nèi)溶質(zhì)與胞周基質(zhì)的相互影響。其具體研究內(nèi)容和結論如下：
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3、3K Da）作為模型蛋白大分子示蹤劑，考察了骨細胞LCS系統(tǒng)內(nèi)的溶質(zhì)輸運與單軸擠壓加載強度（0，2.8或4.8 N）和頻率（0.5，1或2 Hz）的關系。1）依據(jù)共聚焦顯微采集圖像中骨細胞熒光強度的變化，計算了不同加載條件下示蹤分子輸運率（k）及輸運增強度(對流輸運率/擴散輸運率，k/k0)。結果顯示：加載強度增大，溶質(zhì)輸運增強度提高，在0-5 N范圍內(nèi)加載強度與輸運增強度呈正線性關系。加載頻率增加，輸運增強度呈負增長趨勢。2）結合前期

4、LCS輸運數(shù)學模擬模型，根據(jù)所測LCS系統(tǒng)的解剖學參數(shù)，模擬顯示了溶質(zhì)流速與對流輸運增強度的高度相關性。依據(jù)對應不同加載強度和頻率產(chǎn)生的對流輸運增強度，計算了相應狀態(tài)下的小清蛋白的溶質(zhì)輸運速率。4.8N（0.5 Hz）的間歇式循環(huán)加載產(chǎn)生的平均溶質(zhì)流速為55.8μm/s；當加載強度降低至2.8 N，加載產(chǎn)生的平均溶質(zhì)流速減少至43.1μm/s。然而隨著加載頻率依次從0.5、1至2 Hz逐漸增高時，溶質(zhì)平均流速大幅度降低。3）依據(jù)PCM內(nèi)

5、溶質(zhì)分子的滯后、篩分性，計算和模擬了溶質(zhì)與基質(zhì)間相互關系（溶質(zhì)分子反射系數(shù)，Reflection Coefficient）。根據(jù)前期估算所得LCS系統(tǒng)微流體環(huán)境內(nèi)流體流速（58.9μm/s），計算了相同表面應變量下小清蛋白的溶質(zhì)對流速率為53.9μm/s；通過對比流體與溶質(zhì)流速的不同，獲得小清蛋白在本研究小鼠骨LCS內(nèi)的反射系數(shù)約為0.084。
　　②針對彌散性微損傷與線性微裂痕的不同，以熒光素鈉為示蹤分子模擬骨細胞分泌小分子信號

6、或流體，研究了基質(zhì)微損傷對LCS系統(tǒng)在動、靜態(tài)條件下溶質(zhì)擴散輸運的影響。結果顯示：1）無外力作用條件下，彌散性微損傷顯著增大了LCS系統(tǒng)內(nèi)的溶質(zhì)擴散率。2）在高強度拉伸狀態(tài)下（20，30 N），彌散性微損傷區(qū)骨LCS內(nèi)的溶質(zhì)擴散速率顯著提高；但三種拉伸強度（10，20，30 N）間的輸運增強度無顯著差異。
　?、刍诨啄さ鞍拙厶牵≒erlecan/Hspg2，PLN）缺失基因型小鼠的骨組織出現(xiàn)骨小管單位密度下降和骨小管內(nèi)橫斷束帶

7、單位（基質(zhì)纖維）數(shù)量的減少的現(xiàn)象，就PLN缺失小鼠密質(zhì)骨內(nèi)溶質(zhì)自由擴散和對流輸運進行量化。結果表明：1）PLN缺失小鼠骨細胞LCS系統(tǒng)內(nèi)的大分子和小分子的溶質(zhì)擴散率均顯著性提高，對流輸運增強度均呈上升趨勢。2）小清蛋白在對照小鼠和PLN缺失小鼠的骨細胞LCS系統(tǒng)內(nèi)的平均流速分別為48.2μm/s和68.4μm/s。小清蛋白在成年PLN缺失小鼠和正常B6小鼠骨細胞 PCM內(nèi)的反射系數(shù)分別為0.057和0.039。PLN缺失小鼠骨的PCM篩

8、分性顯著性下降。結果證實了PLN缺失改變骨細胞LCS系統(tǒng)的溶質(zhì)輸運。
　　以上結果說明骨組織LCS系統(tǒng)內(nèi)的溶質(zhì)擴散和對流受載荷和生理病理條件的影響。
　　本研究第二部分在前期研究對軟骨與軟骨下骨的溶質(zhì)輸運原位量化的基礎上，就骨關節(jié)炎（OA）和正常軟骨的解剖學數(shù)據(jù)進行測試。結果顯示：
　?、佘浌窍鹿牵⊿B）和鈣化軟骨（CC）層的平均厚度和總體厚度在老齡化關節(jié)組中顯著減小；而DMM的OA組的SB層略微增厚，CC層稍有減小，

9、未鈣化軟骨層（AC）和總體厚度無差異。
　?、趩挝幻娣e上的血管數(shù)量在老齡化和DMM的CC層的分別增加1和0.5倍；相對于正常小鼠關節(jié)潮線（TM）通常無血管存在，老齡化和DMM組TM的平均數(shù)量密度分別高達51和18＃/mm2。DMM小鼠和老齡化小鼠關節(jié)的血管和骨髓空間非常接近鈣化軟骨。結果提示骨關節(jié)炎關節(jié)的軟骨與軟骨下骨間的輸運特性可能增強。
　　本研究第三部分就不同濃度二甲基前列腺素（PGE2）對豬關節(jié)未鈣化軟骨層的三個不同

10、層（淺層、中層和深層）的軟骨細胞的胞內(nèi)鈣濃度的影響進行考察。研究結果顯示，低濃度 PGE2（2.5×10-8 mg/ml）明顯刺激培養(yǎng)和原位關節(jié)軟骨各層軟骨細胞的胞內(nèi)鈣響應；PGE2大幅度正調(diào)節(jié)了淺層的軟骨細胞胞內(nèi)鈣響應，而相對高濃度PGE2（10-6 mg/ml）顯著性正調(diào)節(jié)中層軟骨胞內(nèi)鈣響應。綜合以上檢測信息可知，低濃度PGE2在軟骨細胞的信號輸運通路中具有重要作用。
　　總之，本文三個層次的研究有力地驗證了溶質(zhì)輸運在骨、軟骨