A型急性主動(dòng)脈夾層的分子機(jī)制研究與預(yù)后評(píng)價(jià).pdf

1、第一部分 A型急性主動(dòng)脈夾層主動(dòng)脈組織差異表達(dá)基因的篩選和驗(yàn)證
　　目的:急性主動(dòng)脈夾層(Acute aortic dissection，AAD)是臨床常見的危急重癥，具有較高的致死性，但其分子機(jī)制尚未闡明。本研究通過(guò)全基因組轉(zhuǎn)錄譜芯片分析篩選AAD患者病變主動(dòng)脈組織和正常對(duì)照主動(dòng)脈組織差異表達(dá)的基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析挑選核心差異表達(dá)基因在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)尋找新的有關(guān)主動(dòng)脈夾層發(fā)生的重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑和重要基因及探討這些基

2、因在AAD發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:采用標(biāo)準(zhǔn)的組織收集方法分別收集8例AAD患者和8例正常器官捐獻(xiàn)者的升主動(dòng)脈標(biāo)本。AAD患者和正常對(duì)照各選取4例升主動(dòng)脈組織標(biāo)本進(jìn)行全基因組表達(dá)譜芯片分析，篩選AAD患者和正常對(duì)照主動(dòng)脈組織差異表達(dá)的基因，利用生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的基因可能的生物學(xué)功能，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果挑選可能在AAD發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路和核心基因;然后提取8例AAD患者和8例正常對(duì)照

3、的主動(dòng)脈組織蛋白，通過(guò)Western blotting驗(yàn)證mRNA表達(dá)明顯差異的核心基因在AAD患者和正常對(duì)照主動(dòng)脈組織中的蛋白表達(dá)差異;由于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transform growth factor-β，TGF-β)信號(hào)通路是已知的與AAD發(fā)生相關(guān)的分子通路，同時(shí)在8例AAD患者和8例正常對(duì)照主動(dòng)脈組織中通過(guò)Westernblotting分析了TGF-β通路中關(guān)鍵分子SMAD2和SMAD3的蛋白表達(dá)是否有差異。
　　結(jié)果:

4、(1)基因表達(dá)譜芯片分析顯示，AAD患者病變主動(dòng)脈組織與正常對(duì)照主動(dòng)脈組織比較，mRNA表達(dá)差異大于2倍的基因有129個(gè)，其中83個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，46個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。生物信息學(xué)分析提示，差異表達(dá)的基因主要涉及粘附斑(FN1、ITGA9、PAK7、COL6A3、FLNC)和肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)(FN1、ITGA9、PAK7、PIP5K1B,RRAS2)兩條信號(hào)通路，其中ITGA9基因是編碼整合素α9亞基的基因，在兩條信號(hào)傳導(dǎo)通路中具有關(guān)鍵作用

5、，表達(dá)下調(diào)達(dá)50％。因此本研究挑選了ITGA9作為可能與AAD發(fā)病相關(guān)的核心關(guān)鍵基因;(2) Western blotting分析證實(shí)，AAD患者主動(dòng)脈組織中ITGA9的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照（P=0.003）;(3) Western blotting分析顯示，AAD患者病變主動(dòng)脈組織中磷酸化-SMAD2(p-SMAD2)表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），而總SMAD2、總SMAD3、磷酸化-SMAD3(p-SMAD3)和正常對(duì)照無(wú)顯著差異（P值

6、均＞0.05）。
　　結(jié)論:通過(guò)組織表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)AAD患者病變主動(dòng)脈組織和正常對(duì)照主動(dòng)脈組織的基因表達(dá)譜有較大差異。生物信息分析顯示，主動(dòng)脈夾層病變組織中表達(dá)明顯差異的兩條通路是粘附斑和肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)相關(guān)通路，其中ITGA9基因是同時(shí)參與兩條通路的核心基因;在蛋白水平證實(shí)AAD患者病變主動(dòng)脈組織的ITGA9表達(dá)降低，而傳統(tǒng)TGF-β信號(hào)通路中的p-SMAD2蛋白表達(dá)水平在AAD患者中顯著降低，但其他關(guān)鍵成分無(wú)明顯變化，提示

7、ITGA9基因可能是參與AAD發(fā)生的重要基因，需要進(jìn)一步的功能研究驗(yàn)證其在AAD發(fā)生發(fā)展中的作用;p-SMAD2是否與ITGA9相互作用參與AAD發(fā)病機(jī)制尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分 ITGA9對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞表型的影響
　　目的:主動(dòng)脈中層退行性變是目前被廣為認(rèn)同的主動(dòng)脈夾層的主要發(fā)病機(jī)制，但其確切的分子機(jī)制尚不明確。血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)是維持

8、主動(dòng)脈正常結(jié)構(gòu)和功能的主要成分。VSMC有收縮型和合成型兩種表型，VSMC的表型轉(zhuǎn)換是主動(dòng)脈退行性變的分子機(jī)制之一。前期實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)基因芯片和蛋白水平驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)整合素α9亞基的編碼基因ITGA9在AAD患者病變主動(dòng)脈組織中表達(dá)顯著低于正常對(duì)照。由于ITGA9在主動(dòng)脈VSMC胞膜表達(dá)，且同時(shí)參與細(xì)胞粘附和骨架蛋白調(diào)節(jié)通路，因此推測(cè)ITGA9在AAD的發(fā)病中可能具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)部分?jǐn)M通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究ITGA9表達(dá)改變對(duì)VSMC表型的影

9、響，探討ITGA9表達(dá)下調(diào)在AAD發(fā)病中的可能機(jī)制。
　　方法:首先通過(guò)組織塊貼壁法原代培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC并證實(shí)大鼠主動(dòng)脈VSMC表達(dá)ITGA9;然后將熒光標(biāo)記的小分子RNA探針轉(zhuǎn)染VSMC，觀察小分子RNA在大鼠VSMC中的轉(zhuǎn)染效率;明確小分子RNA可轉(zhuǎn)染大鼠VSMC后，針對(duì)大鼠ITGA9基因設(shè)計(jì)特異性的短鏈干擾RNA(Short interfering RNA，siRNA)，轉(zhuǎn)染大鼠VSMC敲低VSMCITGA9的表達(dá)，W

10、estern blotting檢測(cè)ITGA9敲低后VSMC收縮型標(biāo)志物(SM22α和α-SMA)和合成型標(biāo)志物（OPN和SMemb）表達(dá)變化以及細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察ITGA9敲低后VSMC增殖、遷移能力的變化;最后構(gòu)建腺病毒—ITGA9重組載體，包裝腺病毒，感染經(jīng)血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)誘導(dǎo)呈合成型的VSMC過(guò)表達(dá)ITGA9，Westernblotting檢測(cè)過(guò)表達(dá)ITGA9后VSMC收縮型標(biāo)志物（SM22α和α-SMA）和合成型標(biāo)志

11、物(SMemb)表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)組織塊貼壁法成功培養(yǎng)出原代大鼠主動(dòng)脈VSMC并經(jīng)免疫熒光所鑒定;(2) Western blotting證實(shí)，大鼠主動(dòng)脈VSMC表達(dá)ITGA9，為下一步干預(yù)ITGA9的表達(dá)奠定了基礎(chǔ);(3)熒光標(biāo)記的小分子RNA能順利轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈VSMC;(4)針對(duì)ITGA9設(shè)計(jì)的三條siRNA，其中一條能高效敲低VSMC中ITGA9的表達(dá);(5)ITGA9敲低后，經(jīng)Western blotting證

12、實(shí)，VSMC收縮型標(biāo)志物（SM22α和α-SMA）表達(dá)降低，合成型標(biāo)志物（OPN和SMemb）表達(dá)升高;細(xì)胞劃痕試驗(yàn)顯示，ITGA9敲低后VSMC增殖、遷移能力增強(qiáng)，提示VSMC表型從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換;(6)成功構(gòu)建腺病毒-ITGA9重組載體，腺病毒包裝后病毒滴度達(dá)病毒滴度達(dá)1×109PFU/mL;(7)重組腺病毒感染大鼠主動(dòng)脈VSMC過(guò)表達(dá)ITGA9后，VSMC收縮型標(biāo)志物SM22α顯著升高（P=0.017），α-SMA表達(dá)也升高（

13、P=0.119），SMemb表達(dá)降低（P=0.104），但未到達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:ITGA9表達(dá)改變會(huì)引起VSMC表型的轉(zhuǎn)化，ITGA9的低表達(dá)可能通過(guò)誘導(dǎo)VSMC從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換參與AAD的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ITGA9基因表達(dá)異?？赡軈⑴c主動(dòng)脈夾層發(fā)生的分子機(jī)制。
　　第三部分入院時(shí)D-二聚體水平對(duì)A型急性主動(dòng)脈夾層患者短期和長(zhǎng)期死亡的影響
　　目的:D-二聚體是交聯(lián)的纖維蛋白降解產(chǎn)物，其升高提示凝血和纖

14、溶系統(tǒng)的激活。先前研究提示D-二聚體可作為輔助診斷或排除急性主動(dòng)脈夾層(Acute aorticdissection，AAD)的分子標(biāo)志物，但其作為預(yù)后評(píng)估因素的研究較少。本研究通過(guò)相對(duì)大樣本的研究評(píng)估入院時(shí)D-二聚體水平對(duì)A型AAD患者住院期間和長(zhǎng)期隨訪死亡的影響，旨在探討入院時(shí)D-二聚體水平對(duì)AAD短期和長(zhǎng)期預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　方法:本研究設(shè)計(jì)為單中心、前瞻性、觀察性研究，研究對(duì)象為連續(xù)入選從2010年3月至2011年6月就

15、診于阜外心血管病醫(yī)院急診中心并經(jīng)CT證實(shí)的A型AAD患者。排除標(biāo)準(zhǔn)為主動(dòng)脈壁內(nèi)血腫、主動(dòng)脈透壁潰瘍、外傷性主動(dòng)脈破裂、醫(yī)源性?shī)A層、妊娠、馬凡綜合征、家族性胸主動(dòng)脈夾層等。采集患者入院時(shí)的基線資料，檢測(cè)患者入院時(shí)D-二聚體水平，并記錄患者住院期間的其他臨床資料。主要終點(diǎn)事件為住院期間全因死亡率和長(zhǎng)期隨訪全因死亡率。首先比較存活患者和死亡患者入院時(shí)D-二聚體水平的差異;然后按入院時(shí)D-二聚體水平四分位分組比較各組患者住院死亡率和長(zhǎng)期死亡率;

16、通過(guò)單因素和多因素Cox回歸分析入院時(shí)D-二聚體水平和住院死亡和長(zhǎng)期死亡的相關(guān)性。由手術(shù)治療對(duì)患者預(yù)后有顯著影響，將患者分為手術(shù)治療組和保守治療組，比較兩組中不同D-二聚體水平(＞6.10μ g/mL和≤6.10μg/mL)的患者住院死亡率和長(zhǎng)期死亡率的差異。
　　結(jié)果:入選2010年3月至2011年6月間就診于阜外心血管病醫(yī)院并經(jīng)主動(dòng)脈CT檢查確診的AAD患者共375例，其中A型AAD225例，B型AAD150例。排除13例患者

17、臨床資料不全、失訪或符合排除標(biāo)準(zhǔn)，共212例A型AAD進(jìn)入統(tǒng)計(jì)分析。患者中位住院天數(shù)14天（25％～75％，9～20天），出院后中位隨訪時(shí)間18.8月(25％～75％，6.7～24.4月)?；颊咂骄挲g48.5±11.5歲，男性比例較高(75.9％)。住院期間全因死亡率和長(zhǎng)期隨訪全因死亡率分別為12.7％(27/212)和12.4％(23/185)。與存活者相比，死亡患者入院時(shí)D-二聚體水平顯著增高（中位數(shù)6.8 vs.2.5μg/mL

18、，P＜0.001）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、肌酐水平也顯著高于存活組患者（P值均＜0.001)，但接受手術(shù)治療的比例顯著低于存活組患者（14.0％ vs.74.7％，P＜0.001）。將患者按入院時(shí)D-二聚體四分位分組(Q1:≤1.06μ g/mL; Q2:1.07～2.82μ g/mL; Q3:2.83～6.10μ g/mL; Q4:＞6.10μ g/mL)，第四分位(Q4)組患者住院期間死亡率(30.2％)和長(zhǎng)期隨訪死亡率(24.3％)均顯著高

19、于其他組患者（P＜0.001和P=0.046)。多因素Cox回歸分析顯示，在校正了其他影響住院期間死亡和長(zhǎng)期隨訪死亡的因素后，入院時(shí)D-二聚體＞6.10μ g/mL是影響A型AAD患者住院期間死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=6.124，95％CI1.345-27.892，P=0.019），但入院時(shí)D-二聚體水平和AAD患者長(zhǎng)期死亡無(wú)顯著相關(guān)性。是否接受手術(shù)治療是影響AAD患者住院期間死亡和長(zhǎng)期隨訪死亡最主要因素。將患者按是否接受手術(shù)治療分組后

20、，接受手術(shù)治療的患者中，入院時(shí)D-二聚體＞6.10μ g/mL和≤6.10μ g/mL的患者比較住院期間死亡率和長(zhǎng)期隨訪死亡率無(wú)顯著差異，而保守治療的患者中，入院時(shí)D-二聚體＞6.10μ g/mL的患者住院期間死亡率和長(zhǎng)期隨訪死亡率均顯著高于入院時(shí)D-二聚體≤6.10μ g/mL的患者。
　　結(jié)論:(1)手術(shù)治療是降低A型AAD患者住院期間死亡和長(zhǎng)期死亡的主要措施;(2)入院時(shí)D-二聚體水平增高(＞6.10μ g/mL)增加住院期