蛋白分選受體SorLA對(duì)GDNF調(diào)節(jié)型分泌的調(diào)控.pdf

1、研究背景：
　　 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF），廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)，并對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)多類(lèi)神經(jīng)元的存活，營(yíng)養(yǎng)，突起生長(zhǎng)及分化具有重要的作用，是迄今發(fā)現(xiàn)對(duì)多巴胺神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)作用最強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)因子。眾多對(duì)帕金森氏病動(dòng)物模型研究以及帕金森氏病病人觀察表明，紋狀體和黑質(zhì)中GDNF的增多能夠部分挽救損壞的多巴胺能神經(jīng)元，并且促進(jìn)運(yùn)

2、動(dòng)神經(jīng)元功能的恢復(fù)。因此，GDNF被認(rèn)為對(duì)帕金森氏病等神經(jīng)退行性疾病具潛在療效。目前，國(guó)外生物制藥公司已有使用GDNF治療帕金森氏病的臨床試驗(yàn)。成熟的GDNF以分泌蛋白的形式釋放到胞外，以同源二聚體形式同膜表面受體復(fù)合體結(jié)合，從而激活一系列下游信號(hào)通路，完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。通常，受體復(fù)合體包括兩分子的單跨膜酪氨酸激酶受體RET和兩分子的甘油磷酸肌醇(GPI)錨定細(xì)胞表面蛋白GFRα。
　　 同腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF，神經(jīng)生長(zhǎng)因子NG

3、F一樣，最初合成的GDNF包含一段pro-domain，最終，GDNF以不含pro-domain的成熟形式釋放到胞外。細(xì)胞中GDNF的分泌分為不受外界信號(hào)影響持續(xù)的組成型分泌和受到生理刺激后產(chǎn)生的調(diào)節(jié)型分泌。我們之前研究證實(shí)，pro-domain缺失78堿基GDNF異構(gòu)體GDNFA78調(diào)節(jié)型分泌存在缺陷，提示pro-domain在GDNF的分泌中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而，關(guān)于GDNF分泌調(diào)控的分子機(jī)制目前研究的還不是很清楚。

4、　　 分選蛋白受體SorLA(Sortingprotein-relatedreceptorSorLA)——VPS10P受體家族的一員——在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布。除了少量分布在膜表面外，大部分SorLA聚集在高爾基體，發(fā)揮蛋白分選功能。之前有研究證實(shí)，SorLA同GDNF存在相互作用，然而，SorLA對(duì)GDNF的生物學(xué)功能產(chǎn)生怎樣的影響，以及是如何產(chǎn)生的，需要進(jìn)一步探究。
　　 研究目的：
　　 1)進(jìn)一步明確SorLA和

5、GDNF的相互作用;
　　 2)尋找參與GDNF分泌調(diào)控的關(guān)鍵蛋白:深入研究SorLA在GDNF分泌中的作用;
　　 3)闡釋兩分子之間的作用機(jī)制;
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 免疫共沉淀、westernblot檢測(cè)GDNF、SorLA蛋白相互作用
　　 PC12細(xì)胞共轉(zhuǎn)帶HA標(biāo)簽的GDNF和Flag標(biāo)簽的SorLA，48小時(shí)后，收集細(xì)胞裂解液，取部分直接加samplebuffer煮沸，剩余部分加HA

6、抗體polyHA低溫孵育，2小時(shí)后，加入proteinA瓊脂糖珠子，低溫孵育過(guò)夜。為檢測(cè)酸性條件下兩蛋白的結(jié)合，細(xì)胞裂解之前，使用1M的HCI調(diào)節(jié)設(shè)定pH值。SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，分別使用HA和Flag抗體孵育，相應(yīng)的二抗孵育后，加入增強(qiáng)發(fā)光試劑ECL，顯色，觀察。
　　 免疫熒光檢測(cè)GDNF，SorLA兩分子在細(xì)胞中的共定位
　　 從發(fā)育18天的大鼠胚胎腦中取海馬皮層神經(jīng)元，體外培養(yǎng)7天。脂質(zhì)體共

7、轉(zhuǎn)GDNFHA和FlagSorLA到神經(jīng)元中，24小時(shí)后，4％多聚甲醛固定神經(jīng)元，使用0.4％的TritonX-100透化40分鐘，然后加入10％山羊血清封閉。分別使用HA和Flag抗體孵育1小時(shí)，加入不同熒光二抗避光孵育1小時(shí)，封片，使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察。
　　 GDNF分泌的檢測(cè)
　　 PC12細(xì)胞中同時(shí)存在組成型分泌途徑和調(diào)節(jié)型分泌途徑，因此，本研究使用PC12細(xì)胞檢測(cè)GDNF的分泌。在此細(xì)胞中電轉(zhuǎn)GD

8、NFHA及相應(yīng)的干預(yù)蛋白，48小時(shí)后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入Krebs'-Ringer's-Henseleit(KRH)buffer(125NaCI，4.8KCI,2.6CaCl2,25HEPES,1.2MgSO4,5.6Glucose,lSodiumascorbate，和1.2KH2PO4,以mM為單位）孵育2小時(shí)，收集液體，用于檢測(cè)蛋白組成型分泌。緊接著加高鉀離子KRHbuffer（56mMKCl和75mMNaCl），孵育10分鐘。收集

9、液體，用于檢測(cè)蛋白調(diào)節(jié)型分泌。裂解細(xì)胞，westernblot檢測(cè)細(xì)胞裂解液、組成型分泌液和調(diào)節(jié)型分泌液中GDNF的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 GDNF和SorLA之間存在相互作用
　　 PC12細(xì)胞中共轉(zhuǎn)GDNFHA和FlagSorLA，收集裂解液，分別加入ployHA，proteinA瓊脂糖珠子和M2珠子免疫沉淀，同對(duì)照組相比，在其免疫沉淀物中通過(guò)westernblot檢測(cè)到另外一種蛋白。從而證實(shí)兩蛋白存

10、在于一個(gè)復(fù)合體中。為了排除由于過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的結(jié)合，我們裂解大鼠腦，檢測(cè)兩蛋白的內(nèi)源性結(jié)合情況，結(jié)果表明，在大鼠腦中，GDNF和SorLA存在內(nèi)源性結(jié)合。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)結(jié)果，我們?cè)谂囵B(yǎng)7天的海馬皮層神經(jīng)元中，共轉(zhuǎn)GDNFHA和FlagSorLA，使用免疫熒光的方法檢測(cè)兩蛋白在細(xì)胞中的共定位。結(jié)果顯示，兩者存在較好的共定位。
　　 SorLA促進(jìn)GDNF的調(diào)節(jié)型分泌
　　 大部分SorLA聚集在反式高爾基網(wǎng)（trans-G

11、olginetwork,TGN），少量在膜表面表達(dá)。為了檢測(cè)SorLA發(fā)揮作用的部位，我分別觀察了膜表面和胞內(nèi)的SorLA對(duì)GDNF的影響。膜表面的免疫共沉淀顯示，兩者在此位置沒(méi)有相互作用而且SorLA過(guò)表達(dá)對(duì)GDNF-RET信號(hào)通路的激活沒(méi)有顯著影響。從而排除了SorLA在膜表面影響GDNF信號(hào)通路的可能。
　　 那么，SorLA是否在胞內(nèi)調(diào)節(jié)GDNF的運(yùn)輸呢？我們發(fā)現(xiàn)，在SorLA過(guò)表達(dá)的情況下，GDNF的調(diào)節(jié)型分泌顯著增強(qiáng)

12、而組成型分泌沒(méi)有可見(jiàn)變化。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)結(jié)果，我們構(gòu)建了SorLA的小干擾RNA，小干擾RNA抑制內(nèi)源性SorLA的表達(dá)后，GDNF在組成型分泌沒(méi)有明顯變化情況下其調(diào)節(jié)型分泌顯著降低。另外，我們通過(guò)免疫共沉淀反應(yīng)證實(shí)SorLA同GDNF結(jié)合區(qū)域?yàn)镾orLAvps10p。過(guò)表達(dá)只包含vps10p截短型SorLA突變體，作為dominantnegative影響正常SorLA的功能，結(jié)果顯示GDNF調(diào)節(jié)型分泌明顯受到抑制。SorLA對(duì)GD

13、NF分泌的調(diào)控是通過(guò)作用于GDNFpro-domain實(shí)現(xiàn)的
　　 眾多報(bào)道顯示，各類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子pro-domain在他們的很多功能發(fā)揮中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。為了檢測(cè)GDNFpro-domain是否具有類(lèi)似的功能，我們構(gòu)建了只包含pro-domain和只包含maturedomain的GDNF突變體，免疫共沉淀，觀測(cè)同SorLA-vps10p的結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在中性pH條件下，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變體同SorLA-vps10p均存在結(jié)

14、合。然而，在TGN腔內(nèi)pH(6.4)值環(huán)境下進(jìn)行同樣實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)只有pro-domain結(jié)合，當(dāng)pH值5.5（調(diào)節(jié)型分泌小泡內(nèi)pH值）時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同樣看到只有pro-domain結(jié)合。從而，證實(shí)SorLA對(duì)GDNF分泌的調(diào)控是由存在于TGN的SorLA同GDNFpro-domain結(jié)合，然后攜帶GDNF進(jìn)入調(diào)節(jié)型分泌途徑。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們檢測(cè)了SorLA過(guò)表達(dá)對(duì)GDNFpro-domain和maturedomain兩個(gè)

15、突變體分泌的影響。結(jié)果顯示，SorLA的存在使得GDNFpro-domain的調(diào)節(jié)型分泌明顯增加，對(duì)maturedomain分泌則沒(méi)有任何影響。
　　 SorLA對(duì)GDNF分泌調(diào)控的特異性
　　 我們檢測(cè)了SorLA對(duì)GDNFA78分泌的影響，發(fā)現(xiàn)同對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)SorLA后，GDNFA78組成型分泌和調(diào)節(jié)型分泌均沒(méi)有明顯變化。另外，我們還觀察了vps10p受體家族的另一成員sortilin對(duì)GDNF分泌的影響。結(jié)果

16、表明，sortilin同GDNF存在結(jié)合，然而，酸性pH下這種結(jié)合則消失了。并且過(guò)表達(dá)sortilin對(duì)GDNF分泌沒(méi)有明顯影響。從而表明SorLA對(duì)GDNF作用的特異性，也說(shuō)明pro-domain在此調(diào)控中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1)SorLA跟GDNF之間存在相互作用，兩分子在胞內(nèi)存在于同一個(gè)復(fù)合體中，SorLA共存于包含GDNF的小泡中。
　　 2)SorLA特異性促進(jìn)GDNF調(diào)節(jié)型分泌，

17、而組成型分泌不受明顯影響。
　　 3)GDNFpro-domain在SorLA對(duì)GDNF分泌的調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，證實(shí)了pro-domain在各類(lèi)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子功能發(fā)揮中的重要性。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 4)我們的研究第一次發(fā)現(xiàn)并進(jìn)一步探討SorLA對(duì)GDNF分泌的調(diào)控。
　　 5)我們鑒定出GDNFpro-domain是同SorLA結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。
　　 6)我們的結(jié)果進(jìn)一步提示pro-domai