從G蛋白偶聯(lián)受體119表達(dá)探討清熱降濁方調(diào)控GLP-1分泌的分子機(jī)制.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 一、清熱降濁方及黃連素對(duì)IEC-6細(xì)胞株增殖和凋亡的影響及其對(duì)IEC-6細(xì)胞分泌GLP-1的調(diào)控作用
　　 目的:觀察清熱降濁方及黃連素對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及對(duì)IEC-6細(xì)胞釋放GLP-1的影響，探討清熱降濁方及黃連素對(duì)IEC-6細(xì)胞釋放GLP-1的影響是否與GPR119激活有關(guān)。
　　 方法:采用MTT比色法計(jì)算清熱降濁方及黃連素干預(yù)后的IEC-6細(xì)胞存活率，觀察清熱降濁

2、方對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的影響;采用Annexin V-FITC和PI雙標(biāo)流式術(shù)檢測(cè)清熱降濁方及黃連素對(duì)IEC-6細(xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用放射免疫法，檢測(cè)細(xì)胞上清液中GLP-1、cAMP含量，觀察清熱降濁方及黃連素對(duì)IEC-6細(xì)胞分泌GLP-1的影響及可能的作用途徑。
　　 結(jié)果:利用MTT法檢測(cè)后得到的OD值，計(jì)算IEC-6細(xì)胞存活率，清熱降濁方干預(yù)24h后，與正常胎牛血清培養(yǎng)相比，低濃度中藥復(fù)方組細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.01）

3、，其中2.5％濃度含藥血清組細(xì)胞存活率最高(162.42％)，故選用2.5％濃度含藥血清作為工作濃度。利用WST-1法檢測(cè)后得到的OD值，計(jì)算IEC-6細(xì)胞存活率，黃連素干預(yù)24h后，與正常胎牛血清培養(yǎng)相比，低濃度黃連素組細(xì)胞存活率顯著增加，其中1μg/mL黃連素組細(xì)胞存活率最高(220.17％)，故選用1μg/mL黃連素濃度作為工作濃度。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示，清熱降濁方及黃連素干預(yù)24h后，不同葡萄糖狀態(tài)下細(xì)胞的凋亡

4、率均明顯下降。相比高糖（正常培養(yǎng)，加胎牛血清）組，高糖加含藥血清組細(xì)胞凋亡率下降了7.92％，高糖加黃連素組細(xì)胞凋亡率下降了6.23％;相比低糖（加胎牛血清）組，低糖加含藥血清組細(xì)胞凋亡率下降了10.92％，低糖加黃連素組細(xì)胞凋亡率下降了8.51％;相比超高糖（加胎牛血清）組，超高糖加黃連素組細(xì)胞凋亡率下降了9.3％。放免法檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖加含藥血清組GLP-1含量為2.167±0.167pmol/g，高糖加黃連素組為1.870±0.

5、098pmol/g，均明顯高于高糖加胎牛血清組的GLP-1含量1.687±0.196pmol/g(P＜0.01);低糖加含藥血清組GLP-1含量1.942±0.119pmol/g，低糖加黃連素組為1.565±0.020pmol/g，均明顯高于低糖加胎牛血清組的GLP-1含量1.441±0.102pmol/g（P＜0.01）;超高糖加黃連素組GLP-1含量為2.286±0.105pmol/g，明顯高于超高糖加胎牛血清組的GLP-1含量1.

6、856±0.015(P＜0.01)。高糖加含藥血清組cAMP含量為1.820±0.128pmol/mg，高糖加黃連素組為1.683±0.063pmol/mg，均明顯高于高糖加胎牛血清組的cAMP含量1.539±0.065pmol/mg(P＜0.01);低糖加含藥血清組cAMP含量1.457±0.057pmol/mg，低糖加黃連素組為1.428±0.053pmol/mg，均明顯高于低糖加胎牛血清組的cAMP含量1.249±0.046pmo

7、l/mg(P＜0.01);超高糖加黃連素組cAMP含量為1.799±0.045pmol/g，明顯高于超高糖加胎牛血清組的GLP-1含量1.655±0.069(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:清熱降濁方能夠促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡;促進(jìn)IEC-6細(xì)胞分泌GLP-1，且其促GLP-1分泌作用，與GPR119-cAMP-GLP-1通路激活有關(guān)。黃連素在促進(jìn)IEC-6細(xì)胞增殖、減少凋亡，促進(jìn)GLP-1分泌方面的作用與清熱降濁方

8、一致。
　　 二、清熱降濁方及黃連素對(duì)IEC-6細(xì)胞GLP-1和GPR119蛋白及基因表達(dá)的影響
　　 目的:從基因、蛋白水平探討清熱降濁方及黃連素促進(jìn)IEC-6細(xì)胞分泌GLP-1作用是否與促進(jìn)GPR119表達(dá)有關(guān)。
　　 方法:應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IEC-6細(xì)胞表面GLP-1和GPR119mRNA的表達(dá)，根據(jù)檢測(cè)的Ct值結(jié)果，計(jì)算GLP-1和GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量;應(yīng)用Western blot技術(shù)檢

9、測(cè)IEC-6細(xì)胞表面GLP-1和GPR119蛋白表達(dá)，通過(guò)計(jì)算相對(duì)灰度值，計(jì)算GLP-1和GPR119蛋白相對(duì)含量。
　　 結(jié)果:RT-PCR法檢測(cè)GLP-1和GPR119mRNA表達(dá)，以正常培養(yǎng)（10％胎牛血清）組為基準(zhǔn)樣品，計(jì)算2-△△Ct值，比較相對(duì)表達(dá)量。高糖加復(fù)方含藥血清組GLP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.90359±0.273842，高糖加黃連素組GLP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.75654±0.244486，超高糖

10、加黃連素組GLP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.95339±0.216146，超高糖加胎牛血清組GLP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.47110±0.199938，低糖加復(fù)方含藥血清組GLP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.04591±0.163524，低糖加黃連素組GLP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.94792±0.085629，低糖加胎牛血清組GLP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.54016±0.041613。高糖加復(fù)方含藥血清組GPR119mRNA相

11、對(duì)表達(dá)量為5.00823±0.294559，高糖加黃連素組GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.75283±0.307996，超高糖加黃連素組GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.91934±0.284853，超高糖加胎牛血清組GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量為4.35557±0.237960，低糖加復(fù)方含藥血清組GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00210±0.107958，低糖加黃連素組GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.95795±0

12、.075175，低糖加胎牛血清組GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.44108±0.034275。高糖加復(fù)方含藥血清組、高糖加黃連素組GLP-1mRNA及GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常高糖培養(yǎng)組(P＜0.01);低糖加復(fù)方含藥血清組、低糖加黃連素組GLP-1mRNA及GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于低糖加胎牛血清組(P＜0.01);超高糖加黃連素組GLP-1mRNA和GPR119mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于超高糖加胎牛血

13、清組(P＜0.01)。Westem blot法檢測(cè)GLP-1和GPR119蛋白表達(dá)，計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值之比，結(jié)果為，高糖加復(fù)方含藥血清組GLP-1蛋白相對(duì)含量為1.66333±0.074976，高糖加黃連素組GLP-1蛋白相對(duì)含量為1.26583±0.025262，高糖加胎牛血清組GLP-1蛋白相對(duì)含量為0.90643±0.025290，低糖加復(fù)方含藥血清組GLP-1蛋白相對(duì)含量為0.80650±0.024825，低糖加

14、黃連素組GLP-1蛋白相對(duì)含量為0.79833±0.025201，低糖加胎牛血清組GLP-1蛋白相對(duì)含量為0.49217±0.043582，超高糖加黃連素組GLP-1蛋白相對(duì)含量為1.63833±0.052504，超高糖加胎牛血清組GLP-1蛋白相對(duì)含量為1.24667±0.035387。高糖加復(fù)方含藥血清組GPR119蛋白相對(duì)含量為1.59017±0.056912，高糖加黃連素組GPR119蛋白相對(duì)含量為1.37133±0.03547

15、8，高糖加胎牛血清組GPR119蛋白相對(duì)含量為0.77183±0.025725，低糖加復(fù)方含藥血清組GPR119蛋白相對(duì)含量為0.67033±0.040820，低糖加黃連素組GPR119蛋白相對(duì)含量為0.66643±0.022541，低糖加胎牛血清組GPR119蛋白相對(duì)含量為0.45283±0.024879，超高糖加黃連素組GPR119蛋白相對(duì)含量為1.60883±0.057881，超高糖加胎牛血清組GPR119蛋白相對(duì)含量為0.980

16、58±0.062956。高糖加復(fù)方含藥血清組、高糖加黃連素組GLP和GPR119蛋白相對(duì)含量顯著高于正常高糖培養(yǎng)（高糖加胎牛血清）組(P＜0.01);低糖加復(fù)方含藥血清組、低糖加黃連素組GLP和GPR119蛋白相對(duì)含量顯著高于低糖加胎牛血清組(P＜0.01);超高糖加黃連素組GLP和GPR119蛋白相對(duì)含量顯著高于超高糖加胎牛血清組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:清熱降濁方和黃連素能夠促進(jìn)IEC-6細(xì)胞表面GLP-1的表達(dá)，其促