新型雌激素受體(ER)調(diào)節(jié)因子蛋白的功能研究.pdf

1、雌激素受體(estrogen receptor，ER)是核受體的一種，包括ERα和ERβ兩種，是調(diào)節(jié)與雌激素有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，通過與靶基因上特異性效應(yīng)元件結(jié)合或通過與其他的轉(zhuǎn)錄因子(例如，AP1和SP1)相互作用從而調(diào)節(jié)靶基因的表達。其作用的發(fā)揮需要共調(diào)節(jié)因子(coregulator)的參與。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多ERα的共調(diào)節(jié)因子，包括共激活子和共抑制子。由于ERβ是近期發(fā)現(xiàn)的，所以它的共調(diào)節(jié)因子報道很少。ER在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過

2、程中具有重要作用，是乳腺癌治療的靶標(biāo)和預(yù)后的指標(biāo)。所以，對其共調(diào)節(jié)因子的研究有助于更好地闡明ER的作用機制，對于有效開發(fā)治療乳腺癌的藥物具有重大意義。 GA9是以ERβ為誘餌利用酵母雙雜交技術(shù)從人乳腺cDNA文庫中分離到的未曾報道的與ER相互作用的蛋白質(zhì)(我們先將其命名為GA9)。我們已經(jīng)通過GST沉降和免疫共沉淀實驗獲得了與酵母雙雜交結(jié)果相一致的實驗結(jié)果，證明了GA9與ER之間存在特異性的蛋白質(zhì)間相互作用。為了進一步探究GA

3、9的生物學(xué)功能，我們采用多種分子生物學(xué)方法。在轉(zhuǎn)染含雌激素受體應(yīng)答元件的ERE熒光素酶報告基因?qū)嶒炛校隗w外和哺乳動物細胞中GA9都能夠抑制ER介導(dǎo)的ERE熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)錄活性，而GA9的點突變體則喪失了抑制ER介導(dǎo)的報告基因轉(zhuǎn)錄活性的功能。為了深入研究GA9基因的功能，我們利用包涵體純化蛋白的方法純化了大量的GA9蛋白，通過免疫Balb/c小鼠制備了抗GA9的多克隆抗體，經(jīng)Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)自制的免疫血清具有比較

4、特異的信號，而且抗體效價也較高。利用此抗體我們在不同的乳腺癌細胞系中檢測了GA9的表達，發(fā)現(xiàn)GA9在這些細胞系中存在著表達差異。我們還構(gòu)建了GA9 siRNA真核表達載體，通過熒光素酶實驗，發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾敲低GA9后，ER介導(dǎo)的ERE熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)錄活性明顯增強。同樣，利用自制的抗體通過Western blot實驗我們得到了與上述活性試驗一致的結(jié)果。通過結(jié)晶紫生長曲線實驗，我們發(fā)現(xiàn)GA9可以抑制乳腺癌細胞的生長，而通過RNA干

5、擾敲低GA9后，乳腺癌細胞增殖能力恢復(fù)。根據(jù)GA9基因同源分析，我們判斷GA9可能是ER的DNA或mRNA的甲基化酶。通過熒光素酶實驗，利用特異性甲基化酶抑制劑AZA(5-aza-2’deoxycytidine)處理后的GA9，喪失了對ER介導(dǎo)的ERE熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)錄活性的抑制，且呈現(xiàn)出梯度效應(yīng)。 這些研究結(jié)果表明，GA9可能是雌激素信號通路的一個新型調(diào)控因子。進一步的深入研究將有助于了解雌激素信號通路的調(diào)控機制及其臨床治