OECs過表達(dá)esRAGE對(duì)AGE誘導(dǎo)RMECs炎癥反應(yīng)的影響作用.pdf

1、目的:
　　內(nèi)源分泌型晚期糖基化終產(chǎn)物受體( endogenous secretory receptor for advanced glycation end products,esRAGE)屬于分泌型糖基化終產(chǎn)物受體(sRAGE)的一種剪接變異體,具有與 RAGE競(jìng)爭(zhēng)配體晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)的作用,干擾AGE/RAGE信號(hào)通路,從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。OECs(outgrowth endothelial cells)

2、屬于晚期內(nèi)皮細(xì)胞,也叫成熟內(nèi)皮細(xì)胞,對(duì)炎癥性視網(wǎng)膜病變的血管有潛在的修復(fù)功能,同時(shí)也是一種較好的基因載體。本研究借助OECs為基因載體,同時(shí)增加細(xì)胞esRAGE基因的表達(dá),以期達(dá)到在修復(fù)受損血管的同時(shí),阻斷有AGE誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。
　　方法:
　　構(gòu)建過表達(dá)esRAGE基因腺病毒載體;收集SD大鼠新鮮外周血,密度梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞,根據(jù)免疫表型鑒定OECs;將構(gòu)建成功的腺病毒載體轉(zhuǎn)入OECs細(xì)胞中,鑒定目

3、的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況;用AGE-BSA誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RMECs)炎癥性改變,將轉(zhuǎn)染Ad-esRAGE的 OECs與AGE誘導(dǎo)的RMECs共培養(yǎng),觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞炎癥因子表達(dá)情況;TUNEL法鑒定AGE誘導(dǎo)的RMECs細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染Ad-esRAGE的OECs與AGE誘導(dǎo)的RMECs共培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡情況,明確病毒與OECs細(xì)胞對(duì)AGE誘導(dǎo)的RMECs凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了過表達(dá)esRAGE

4、腺病毒載體。
　　2、內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD133、VEGFR-2對(duì)OECs細(xì)胞驗(yàn)證,流式結(jié)果分別為5.41％、3.45%、91.50%,提示成功分離培養(yǎng)OECs。
　　3、RTQ-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染esRAGE腺病毒實(shí)驗(yàn)組比轉(zhuǎn)染control病毒的對(duì)照組高出近13倍;Western-blot結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組存在esRAGE的表達(dá),而對(duì)照組蛋白未見esRAGE表達(dá)的條帶;ELISA結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組高出近6

5、倍,提示Ad-esRAGE已成功轉(zhuǎn)染OECs細(xì)胞并在其內(nèi)表達(dá),且向外分泌esRAGE;
　　4、RMECs細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,DAPI染細(xì)胞核成藍(lán)色,VIII-FITC表現(xiàn)為綠色,而胞膜和胞漿出現(xiàn)綠色熒光,表明 VIII因子抗原主要在胞膜和胞漿中表達(dá),而RMECs內(nèi)VIII因子抗原主要表達(dá)于胞膜和胞漿中,提示已成功分離培養(yǎng)RMECs。
　　5、AGE-BSA濃度為100ug/ml作用RMECs24h后,NF-κB表達(dá)明顯增

6、加(P<0.01),細(xì)胞內(nèi)RGAE以及炎性因子VEGF、TGF-β、MCP-1均有不同程度的表達(dá)增多,并呈濃度和時(shí)間依賴性。AGE-BSA濃度為100ug/ml作用RMECs12h,細(xì)胞內(nèi)RGAE以及炎性因子VEGF、TGF-β、MCP-1的表達(dá)與對(duì)照組相比,組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6、共聚焦結(jié)果顯示,綠色熒光標(biāo)記的RMECs與紅色熒光標(biāo)記的OECs可融合并形成管狀結(jié)構(gòu)。
　　7、RTQ-PCR和Wes

7、tern-blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Ad-esRAGE-OECs細(xì)胞作用于AGE誘導(dǎo)的RMECs細(xì)胞后,RMECs細(xì)胞內(nèi)RAGE以及炎癥因子NF-кB、VEGF、TGF-β、MCP-1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下降,組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　8、AGE誘導(dǎo)的RMECs炎癥細(xì)胞組和Ad-esRAGE-OECs組細(xì)胞凋亡相比,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、OECs細(xì)胞可以作為e

8、sRAGE基因載體,esRAGE基因轉(zhuǎn)染后的 OECs細(xì)胞具有外分泌esRAGE作用。
　　2、AGE能誘導(dǎo)RMECs細(xì)胞炎癥反應(yīng),明顯增加細(xì)胞RAGE以及炎癥因子NF-κB、VEGF、TGF-β和MCP-1的表達(dá)水平。
　　3、基因轉(zhuǎn)染后的OECs分泌esRAGE能夠明顯減輕AGE能誘導(dǎo)RMECs細(xì)胞炎癥反應(yīng),明顯降低RMECs細(xì)胞RAGE以及炎癥因子NF-κB、VEGF、TGF-β和MCP-1的表達(dá)水平。
　　4、