肥大細胞參與Lgr5+結直腸癌干細胞干性維持作用機制的初步探討.pdf

1、第一部分 Lgr5+、RSPO-1、C-kit在人類結直腸癌中的表達及臨床意義
　　目的：探討人類結直腸癌組織中浸潤型肥大細胞的表達情況，及其分泌的RSPO-1蛋白的表達與臨床病理資料之間的關系。
　　方法：2012年3月~2012年4月，收集結直腸癌、癌周組織及手術近端切緣組織標本21例，采用免疫組織化學染色方法、雙標免疫熒光方法和免疫蛋白印跡法檢測各組織中RSPO-1和C-kit蛋白的表達，實時定量聚合酶鏈反應檢測RSP

2、O-1和Lgr5的mRNA的表達。比較肥大細胞及其表達的RSPO-1與臨床病理特征。
　　結果：免疫組化檢測發(fā)現RSPO-1在結直腸癌組織、癌周組織的陽性表達率分別為90.48％和100%，高于手術近端切緣組織的80.95%，差異有統計學意義（P<0.0001）；C-kit在癌周組織、手術近端切緣組織的陽性表達率分別為100%和80.95%，高于癌組織28.57%，差異有統計學意義（P<0.0001）；癌周組織中C-kit的強陽性

3、（++）表達強度與腫瘤分化程度及淋巴結轉移分站情況呈正相關（P值分別為0.02和0.015），而RSPO-1的強陽性（++）表達與腫瘤分化程度、淋巴轉移、浸潤深度和分期無明顯相關性（P值分別為0.194、0.114、0.5、0.44）；實時定量聚合酶鏈反應和免疫蛋白印跡檢測結直腸癌組織中 Lgr5的相對表達也明顯高于癌周組織，癌周組織中的RSPO-1相對表達量明顯高于腫瘤及近端切緣組織。
　　結論人類結直腸癌局部環(huán)境中的具有浸潤型

4、肥大細胞，同時也表達RSPO-1，癌周組織局部環(huán)境中浸潤型肥大細胞的密度與腫瘤分化程度及淋巴結轉移分站呈正相關；人類結直腸癌組織中的受體 Lgr5呈明顯高表達狀態(tài)。因此，浸潤型肥大細胞分泌的 RSPO-1可能與結直腸癌干細胞表面受體 Lgr5結合共同維持結直腸癌干細胞突變的穩(wěn)定性及部分惡性生物學效應。
　　第二部分肥大細胞參與小鼠結腸癌干細胞干性維持的研究
　　目的：浸潤型肥大細胞介導的 RSPO-1在小鼠結直腸癌干細胞系

5、CT-26(wt)中影響Wnt/β-catenin信號通道的機制研究
　　方法：培養(yǎng)小鼠浸潤型肥大細胞系P815，小鼠結腸癌細胞系CT-26；將普通CT-26細胞進行無血清懸浮培養(yǎng)獲得球細胞：提取細胞RNA進行干性檢測；將P815細胞系通過不同濃度SCF進行刺激懸浮培養(yǎng)，提取細胞蛋白質檢測RSPO-1等目的蛋白的表達情況；將CT-26球細胞與P815細胞進行無血清不同干預懸浮共培養(yǎng)，觀察生長情況后提取CT-26球細胞的總RNA及蛋

6、白質，用Real-time PCR、Western-blot檢測細胞系中β-catenin、TCF1/4、c-Myc mRNA及蛋白表達情況。
　　結果：Western-Blot顯示小鼠浸潤型肥大細胞系P815在受到10ng/ml的SCF刺激后48h表達的RSPO-1明顯升高，伴隨著SCF濃度的增加和刺激時間的增加，RSPO-1表達無明顯增高趨勢；受SCF刺激后Gremlin及Noggin不表達；Real-time PCR檢測CT

7、-26球細胞受到RSPO-1刺激后的球細胞CD133+及SOX2干性標記物表達明顯高于未受刺激及阻斷RSPO-1的細胞群；Western-Blot顯示：CT-26球細胞與P815細胞系懸浮共培養(yǎng)后下游 Wnt/β-catenin信號通道活化，胞漿及胞核內的β-catenin、Tcf4及c-Myc蛋白明顯高于較未受刺激及阻斷組細胞系。
　　結論小鼠肥大細胞介導的RSPO-1可刺激結腸癌干細胞下游Wnt/β-catenin信號通路的活

8、化，β-catenin在胞漿累積進入胞核內激活轉錄因子TCF/Lef家族成員，因此肥大細胞介導的RSPO-1對結腸癌腫瘤干細胞的“干性”維持具有重要作用。
　　第三部分肥大細胞參與Lgr5+小鼠結腸炎癌模型中Wnt/β-catenin通路活化的研究
　　目的：浸潤型肥大細胞介導的 RSPO-1在小鼠 Lgr5+結直腸炎癌模型中影響Wnt/β-catenin信號通道的機制研究
　　方法：通過經典的化學誘導法（AOM+2%

9、DSS）構建Balb/c雌性小鼠結腸炎癌模型。觀察生長情況后，分別在第8周、16周和32周通過免疫組化和流失細胞儀檢測小鼠Lgr5+結腸癌及癌周組織中肥大細胞數量和β-catenin、TCF4、c-Myc基因表達情況。通過Western-blot方法檢測小鼠結腸癌組織、癌周組織及正常組織的RSPO-1表達情況。
　　結果：入組的雌性小鼠在第32周成瘤率為20%（2/10）；Balb/c小鼠注射AOM及飲2%DSS后2和4周，死亡率

10、分別達到20%（2/10）和40%（4/10）；對比正常組或炎癥組（僅 DSS誘導），Lgr5+結腸上皮細胞（CD45-、CD31-、CD326+）的比例及其Wnt//β-catenin信號通路的活化水平均明顯增加；AOM+2%DSS誘導組的結腸癌模型小鼠其β-catenin、TCF、c-Myc明顯增高，浸潤肥大細胞定位于結腸癌侵襲生長的邊緣，其分泌的RSPO-1蛋白明顯增高。
　　結論小鼠結腸炎癌模型中肥大細胞介導的RSPO-1