以蛋白酶體為靶點(diǎn)的地錢素M誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞死亡的機(jī)制研究.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer, PCa)是歐美國家老年男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌。雖然我國前列腺癌的發(fā)病率明顯低于西方國家，但隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變等，我國前列腺癌發(fā)病率，特別是晚期前列腺癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)。據(jù)預(yù)計(jì)10年后，前列腺癌在我國的發(fā)病率可能會(huì)超過60-70/10萬，已成為威脅我國老年男性健康的惡性疾病之一。
　　前列腺癌是激素依賴性腫瘤，因此內(nèi)分泌治療是治療前列腺癌的首選標(biāo)準(zhǔn)方案。

2、然而絕大多數(shù)前列腺癌患者經(jīng)內(nèi)分泌治療1-2年后易發(fā)展為激素難治性前列腺癌（Hormone Refractory Prostate Cancer，HRPC），對(duì)雄激素撤除不敏感，抵抗凋亡并伴隨侵襲轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，死亡率高，目前臨床尚無有效的治療方法。由于HRPC的演變是復(fù)雜的多因素、多信號(hào)途徑參與的過程，其機(jī)制尚小完全清楚，因此尋找有效的治療靶點(diǎn)及機(jī)制，產(chǎn)生多種途徑的協(xié)同效應(yīng)，是治療前列腺癌的有效策略之一。
　　第一部分地錢素M抑制蛋

3、白酶體的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核生物細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系之一。UPS通過將小分子蛋白泛素與靶蛋白的賴氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，從而將其泛素化。泛素標(biāo)記的蛋白被蛋白酶體特異性地識(shí)別并迅速降解。UPS通常降解受損變性蛋白、短壽命的調(diào)控蛋白等，對(duì)于細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)、凋亡與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程起著重要的調(diào)控作用。惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白代謝紊亂，蛋白酶體

4、活性升高，UPS調(diào)節(jié)失衡，使得腫瘤細(xì)胞更加依賴UPS，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。因此，腫瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑更加敏感，蛋白酶體也成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，開發(fā)針對(duì)UPS的抑制劑在腫瘤治療中具有廣闊的前景，而天然化合物以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、多樣的生物學(xué)活性更是備受關(guān)注。
　　雙聯(lián)芐(Bisbibenzyls)是苔蘚植物中分離得到的一類大環(huán)多酚類化合物，因聯(lián)芐之間的連接方式不同、取代基不同而具有結(jié)構(gòu)新穎、多樣的特點(diǎn)，具有抗真菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物

5、活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)雙聯(lián)芐類化合物地錢素M(Marchantin M，Mar)顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡。由于地錢素M的結(jié)構(gòu)與茶多酚的功能區(qū)域相似，而茶多酚已被證明是蛋白酶體的不可逆抑制劑。我們推測(cè)地錢素M可能具有抑制蛋白酶體活性的功能。為此，我們研究了地錢素M對(duì)重組純化的20S蛋白酶體、前列腺癌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性的影響，并對(duì)其生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行了分析，取得了以下研究結(jié)果:
　　一、地錢素M顯著抑制蛋白酶體活性，是新

6、的可逆性蛋白酶體抑制劑
　　1.地錢素M顯著抑制蛋白酶體胰凝乳樣蛋白酶(ChT-L)和肽基谷氨酰多肽解酶(PGPH)活性。Mar顯著抑制重組純化的20S蛋白酶體中ChT-L和PGPH活性，呈劑量依賴性。其半數(shù)抑制率分別為6.99和5.33μM。但不影響胰蛋白酶樣活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，地錢素M對(duì)激素非依賴性前列腺癌PC3，DU145細(xì)胞和激素依賴性前列腺癌LNCaP細(xì)胞內(nèi)26S蛋白酶體顯示同樣的抑制作用，且呈時(shí)間和劑量依賴性。表達(dá)差異

7、譜基因芯片數(shù)據(jù)顯示，地錢素M并不影響UPS途徑中各組分的基因表達(dá)。
　　2.地錢素M是新的可逆性蛋白酶體抑制劑。通過Autodock vina軟件分析發(fā)現(xiàn)，地錢素M能與蛋白酶體的β1(PGPH)和β5(ChT-L)亞基結(jié)合。二者主要依靠氫鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵相互作用，其自由能分別為:-7.4 kcal/mol和-6.5kcal/mol。林-貝氏雙倒數(shù)作圖法表明，地錢素M對(duì)蛋白酶體的抑制呈現(xiàn)較典型的非競爭性抑制的方式。上述結(jié)果表明，

8、地錢素M是一種新的蛋白酶體可逆的抑制劑。
　　3.地錢素M抑制蛋白酶體活性，導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞內(nèi)多泛素化蛋白累積，且呈時(shí)間、劑量依賴性。
　　二、地錢素M抑制蛋白酶體活性，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑(ERAD)受阻，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡
　　1.地錢素M介導(dǎo)的蛋白酶體抑制，抑制ERAD，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。地錢素M處理前列腺癌細(xì)胞后，導(dǎo)致經(jīng)ERAD降解的蛋白如突變蛋白CFTR△F508、SPC△4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積;電鏡下觀察

9、到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，激光共聚焦結(jié)果顯示高濃度的地錢素M可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化;Western blotting結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78表達(dá)顯著上調(diào)、PERK及其下游eIF2。磷酸化水平升高;定量PCR分析顯示應(yīng)激分子ATF6、ATF4及其靶基因ATF3表達(dá)顯著增加;IRE1激活并剪接XBP1的mRNA，激活XBP1。上述結(jié)果表明，地錢素M抑制蛋白酶體活性導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白累積，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　2.地錢素M誘導(dǎo)

10、前列腺癌細(xì)胞凋亡。地錢素M呈劑量依賴性抑制激素依賴、激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡，且使激素依賴性細(xì)胞更易凋亡。Western blotting結(jié)果表明，地錢素M可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異caspase4，從而激活caspase3，誘導(dǎo)凋亡。
　　3.Caspase非依賴途徑參與地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在激素依賴的前列腺癌LNCaP細(xì)胞中，Caspase抑制劑z-VAD-fmk逆轉(zhuǎn)絕大多數(shù)地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而在激素非依賴的前列腺癌PC3

11、和DU145細(xì)胞中，z-VAD-fmk只能部分部分逆轉(zhuǎn)地錢素M介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上述結(jié)果表明，地錢素M主要通過caspase依賴的途徑誘導(dǎo)激素依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡，而通過caspase依賴和非依賴機(jī)制誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞死亡。
　　第二部分、地錢素M上調(diào)應(yīng)激基因ATF3的表達(dá)而抑制激素依賴性前列腺癌細(xì)胞中AR的功能雄激素受體(Androgen receptor，AR)為核受體型轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)雄激素（如睪酮、二氫睪酮）與AR結(jié)

12、合后，引起AR構(gòu)象改變，使AR與熱休克蛋白解離、活化而轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，并形成同源二聚體與DNA分子中雄激素受體應(yīng)答元件（AREs）結(jié)合，誘導(dǎo)下游靶基因如前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長和存活。因此，AR信號(hào)通路不僅在維持前列腺的正常發(fā)育、功能發(fā)揮中起主要作用，也是激素依賴性前列腺癌增殖的關(guān)鍵途徑，而且在激素非依賴性轉(zhuǎn)化過程中起決定性作用，并在約1/3的HRPC中持續(xù)

13、性高表達(dá)。AR基因擴(kuò)增、突變、過表達(dá)以及AR激素非依賴性激活，均可引起AR功能的異常活化，是前列腺癌內(nèi)分泌治療失敗、侵襲轉(zhuǎn)移、抵抗凋亡等惡性表型的重要機(jī)制之一。因此，有效抑制前列腺癌中AR的表達(dá)或和功能一直是倍受關(guān)注的研究課題。
　　ATF3(activating transcription factor3)作為轉(zhuǎn)錄因子ATF/CREB家族成員，通過其蛋白堿性區(qū)的亮氨酸拉鏈結(jié)合到特異DNA的ATF/CREB順式作用元件上，調(diào)控基因

14、表達(dá)。當(dāng)DNA損傷、毒素暴露、氧化應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，ATF3可被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，以維持細(xì)胞在應(yīng)激條件下的基因組完整性和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，在持續(xù)或過強(qiáng)的應(yīng)激狀態(tài)下，ATF3可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于ATF3蛋白中的亮氨酸拉鏈可介導(dǎo)ATF3與多種蛋白相互作用。本課題第一部分研究結(jié)果顯示，地錢素M誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，顯著增加ATF3表達(dá)，且主要以caspase依賴的凋亡形式誘導(dǎo)激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP死亡。由于AR是LNCaP細(xì)胞增殖存活的關(guān)鍵調(diào)

15、控因子，我們研究了ATF3高表達(dá)對(duì)AR表達(dá)和功能的影響以及與LNCaP凋亡的關(guān)系，結(jié)果如下:
　　一、地錢素M通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)PERK/eIF2α/ATF4上調(diào)ATF3的表達(dá)
　　1.地錢素M在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)ATF3的表達(dá)。地錢素M顯著增加前列腺癌細(xì)胞中ATF3啟動(dòng)子活性，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。利用MatInspector軟件分析ATF3啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)-22/-18區(qū)存在ATF的結(jié)合位點(diǎn);通過構(gòu)建ATF3啟動(dòng)子及其系

16、列截短體和ATF結(jié)合區(qū)的點(diǎn)突變和缺失突變的報(bào)告基因載體。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明，ATF結(jié)合位點(diǎn)對(duì)地錢素M誘導(dǎo)的ATF3轉(zhuǎn)錄激活至關(guān)重要。
　　2.地錢素M誘導(dǎo)的ATF3表達(dá)上調(diào)主要受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)PERK/eIF2α/ATF4的調(diào)控。通過顯性負(fù)相關(guān)表達(dá)載體抑制PERK的活性或siRNA下調(diào)ATF4的表達(dá)均能顯著下調(diào)ATF3的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞存活。
　　二、地錢素M誘導(dǎo)的ATF3高表達(dá)促進(jìn)LNCaP細(xì)胞凋亡
　　1.抑

17、制ATF3的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞存活。利用顯性負(fù)相關(guān)或siRNA技術(shù)抑制ATF3的表達(dá)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LNCaP細(xì)胞的存活率顯著提高;AnnexinV-FITC/PI雙染結(jié)果表明，下調(diào)ATF3后，凋亡細(xì)胞顯著減少。
　　2.ATF3通過caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western-blotting結(jié)果顯示，降低ATF3的表達(dá)，可抑制caspase3的活化，使caspase3的底物PARP剪切減少。上述結(jié)果表明，地錢素M上調(diào)ATF3

18、的表達(dá)促進(jìn)LNCaP經(jīng)caspase依賴的途徑凋亡。
　　三、高表達(dá)的ATF3通過蛋白間相互作用抑制AR的功能、促進(jìn)LNCaP細(xì)胞凋亡
　　1.地錢素M顯著上調(diào)ATF3蛋白水平。Western-blotting結(jié)果顯示，地錢素M顯著提高ATF3的蛋白表達(dá)，而且在激素依賴性前列腺癌細(xì)胞LNCaP中的誘導(dǎo)作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145。
　　2.ATF3與AR相互作用抑制其功能。免疫共沉淀結(jié)果顯示，

19、地錢素M誘導(dǎo)的ATF3與AR結(jié)合。在LNCaP細(xì)胞中過表達(dá)ATF3顯著下調(diào)AR的靶基因PSA的啟動(dòng)子活性及其mRNA水平，其它AR調(diào)控的靶基因，如TMPRSS23和NKX3.1等表達(dá)均明顯下調(diào)。利用siRNA干擾ATF3后，上述AR靶基因都有不同程度的恢復(fù)表達(dá)。當(dāng)AR缺失的PC3細(xì)胞共轉(zhuǎn)染AR，PSA啟動(dòng)子和不同劑量的ATF3表達(dá)載體后，PSA啟動(dòng)子活性隨ATF3表達(dá)量的增加而降低。以上結(jié)果說明地錢素M誘導(dǎo)的ATF3通過與AR結(jié)合而抑制

20、其功能，從而誘導(dǎo)LNCaP細(xì)胞凋亡。
　　第三部分、地錢素M誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞自噬性死亡在激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145中，阻斷caspase依賴的細(xì)胞凋亡，只能部分逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，提示caspase非依賴的細(xì)胞死亡機(jī)制參與地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程。
　　已有研究表明，抑制蛋白酶體活性不僅能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，還可通過多種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞自噬（autophagy）。自噬是真核細(xì)胞內(nèi)除UPS外，

21、另外一種蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，主要通過自噬泡包裹細(xì)胞胞液的內(nèi)容物，包括衰老或受損的亞細(xì)胞器如線粒體、長壽命蛋白、入侵的微生物等運(yùn)送至溶酶體降解，降解產(chǎn)物可以被細(xì)胞再次利用。當(dāng)細(xì)胞面臨各種刺激、應(yīng)激時(shí)，自噬可被誘導(dǎo)增強(qiáng)，可通過出現(xiàn)的自噬泡、自噬相關(guān)基因的表達(dá)等方法進(jìn)行檢測(cè)。自噬對(duì)腫瘤細(xì)胞具有雙重作用，在腫瘤發(fā)生的不同階段，自噬所起的作用不同。在正常條件下，基礎(chǔ)性自噬可清除細(xì)胞內(nèi)可能產(chǎn)生毒性作用的受損成分，抑制細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，預(yù)防腫瘤發(fā)生。當(dāng)

22、腫瘤細(xì)胞面臨乏氧、營養(yǎng)缺乏以及化療藥物時(shí)，自噬的激活會(huì)提供能量、營養(yǎng)物質(zhì)等而對(duì)腫瘤細(xì)胞起到保護(hù)作用，有利于細(xì)胞存活。然而多種應(yīng)激而產(chǎn)生持續(xù)、過度的自噬時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，稱為自噬性細(xì)胞死亡(autophagic celldeath)，即Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡。地錢素M處理的前列腺癌細(xì)胞，不僅使自噬的標(biāo)志性蛋白LC3的表達(dá)增加，而且促進(jìn)LC3(Ⅰ)向LC3(Ⅱ)轉(zhuǎn)變，表明地錢素M能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬。因此，我們研究了地錢素M誘導(dǎo)的自噬

23、在前列腺癌細(xì)胞死亡過程中的作用，并對(duì)其信號(hào)通路進(jìn)行了探討，取得了以下研究成果:
　　一、地錢素M抑制蛋白酶體活性，幾乎同時(shí)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生
　　1.地錢素M抑制蛋白酶體活性伴隨著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬。時(shí)相分析結(jié)果顯示，地錢素M處理細(xì)胞1h時(shí)，蛋白酶體活性顯著下降，而在處理2h后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78的表達(dá)顯著上調(diào)、自噬標(biāo)志性蛋白LC3(Ⅱ)的表達(dá)開始上調(diào)并持續(xù)增強(qiáng)至48h。此結(jié)果表明，地錢素M抑制蛋白酶體活性后，隨即引起內(nèi)質(zhì)

24、網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬。
　　2.地錢素M顯著誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬。LC3Ⅱ的表達(dá)升高提示該化合物可使細(xì)胞產(chǎn)生自噬。透射電鏡的結(jié)果明確顯示，地錢素M使激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞中自噬泡和自噬溶酶體明顯增多，為自噬提供直接證據(jù)。激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-LC3表達(dá)載體或利用GFP-LC3穩(wěn)轉(zhuǎn)的U87細(xì)胞株，均可觀察到地錢素M極顯著地誘導(dǎo)LC3聚集、產(chǎn)生聚集熒光斑點(diǎn)。
　　3.地錢素M誘導(dǎo)自噬流量的增加。基因芯片和定量PCR結(jié)

25、果表明，地錢素M在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)LC3基因表達(dá)升高，而其它自噬相關(guān)基因如Atg5、Atg7、Beclin1等表達(dá)幾乎沒有變化。Western blotting結(jié)果顯示地錢素M不僅上調(diào)LC3的蛋白水平，而且促進(jìn)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)變，并引起自噬底物p62下降。利用氯喹阻斷自噬泡和溶酶體融合進(jìn)一步增加地錢素M誘導(dǎo)的LC3Ⅱ的累積，而利用自噬抑制劑3-MA則顯著抑制地錢素M誘導(dǎo)的LC3熒光斑點(diǎn)的聚集。這些結(jié)果表明地錢素M抑制蛋白酶體活性后，迅速

26、誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬，顯著增加自噬流量。
　　二、地錢素M誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞自噬性死亡
　　1.自噬抑制劑逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。自噬抑制劑3-MA顯著下調(diào)地錢素M誘導(dǎo)的LC3Ⅱ的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞存活，降低地錢素M介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。利用E-64D/Pepstatin A抑制溶酶體酶的活性，使地錢素M誘導(dǎo)的LC3Ⅱ的表達(dá)略有增加，但依然顯著增加細(xì)胞的存活，逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
　　2.抑制自噬相

27、關(guān)基因逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。利用siRNA特異性的降低Atg5、Atg7、LC3的表達(dá)，均可顯著抑制LC3Ⅱ的表達(dá)或增加p62的表達(dá)而抑制自噬，同時(shí)顯著逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，增加細(xì)胞存活率。然而干擾Beclin1后并不影響地錢素M介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上述結(jié)果表明，地錢素M誘導(dǎo)的自噬為自噬性死亡。
　　3.抑制自噬和caspase凋亡途徑完全逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。由于caspase抑制劑只部分逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的激素非依

28、賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡，采用siRNA下調(diào)Atg5的表達(dá)抑制自噬、同時(shí)聯(lián)用caspaSe抑制劑，幾乎完全逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞死亡。因此，自噬性細(xì)胞死亡和caspase依賴的細(xì)胞凋亡并存于地錢素M的細(xì)胞毒作用。
　　三、地錢素M通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)PERK/eIF2α和PI3K/Akt/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬
　　1.地錢素M通過下調(diào)Akt1的表達(dá)抑制PI3K/Akt/mTOR途徑誘導(dǎo)自噬。Westernblo

29、tting結(jié)果顯示，地錢素M首先下調(diào)phospho-PDK1、phospho-Akt以及總Akt蛋白的表達(dá)水平，隨后降低phospho-mTOR和phospho-p70S6K的水平，表明地錢素M通過抑制PI3K/Akt/mTOR途徑而誘導(dǎo)自噬。定量PCR結(jié)果顯示，與Akt2、Akt3相比，地錢素M極顯著地抑制Akt1的mRNA水平。持續(xù)活化的Akt1表達(dá)載體能夠顯著逆轉(zhuǎn)地錢素M誘導(dǎo)的LC3Ⅱ表達(dá)及細(xì)胞死亡，而野生型Akt1無此作用。此結(jié)

30、果表明，地錢素M通過下調(diào)Akt的表達(dá)、抑制PI3K的活性，使Akt磷酸化水平下降，從而使mTOR失活而誘導(dǎo)自噬。
　　2.地錢素M誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)促進(jìn)自噬。利用JNK抑制劑阻斷JNK/c-Jun信號(hào)并不影響地錢素M誘導(dǎo)LC3Ⅱ表達(dá)及細(xì)胞死亡，而轉(zhuǎn)染顯性負(fù)相關(guān)的PERK表達(dá)載體或siRNA抑制PERK，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)PERK/eIF2α，地錢素M誘導(dǎo)的LC3Ⅱ表達(dá)顯著下調(diào)、并部分逆轉(zhuǎn)其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上述結(jié)果表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

31、信號(hào)PERK/eIF2。參與了地錢素M誘導(dǎo)的自噬及細(xì)胞死亡過程。
　　第四部分結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)一、結(jié)論
　　1.雙聯(lián)芐化合物地錢素M抑制蛋白酶體活性，是一新型可逆性蛋白酶體抑制劑。
　　2.地錢素M通過抑制蛋白酶體活性、阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白降解途徑而誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞死亡。
　　3.地錢素M通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、促進(jìn)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子ATF3的高表達(dá);而高表達(dá)的ATF3通過與AR發(fā)生蛋白間相互作用抑制AR功能，

32、從而誘導(dǎo)激素依賴性前列腺癌細(xì)胞主要發(fā)生細(xì)胞凋亡。
　　4.地錢素M通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞自噬，促進(jìn)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞發(fā)生caspase依賴的凋亡和自噬性細(xì)胞死亡。
　　二、創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處
　　1.首次報(bào)道雙聯(lián)芐化合物地錢素M靶向蛋白酶體、是一新型的可逆性蛋白酶體抑制劑。由于不可逆性蛋白酶體抑制劑易產(chǎn)生較大毒性，因此地錢素M的作用特點(diǎn)，使其成為很有研究價(jià)值的天然產(chǎn)物。
　　2.首次報(bào)道地錢素M可通過應(yīng)激蛋

33、白ATF3而抑制AR的功能，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由于 LNCaP細(xì)胞表達(dá)的是突變型AR，地錢素M的這種抑制作用將有益于AR持續(xù)活化的前列腺癌的治療。但地錢素M對(duì)野生型AR的作用有待于進(jìn)一步研究。
　　3.首次報(bào)道地錢素M可誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌自噬性細(xì)胞死亡。由于大多數(shù)化療藥物如紫杉醇等可引起腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬性保護(hù)機(jī)制，削弱其抗腫瘤效果，而且激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞比激素依賴性細(xì)胞抗凋亡能力強(qiáng)，對(duì)藥物敏感性差。地錢素M對(duì)激素依賴、