硫胺素對成年小鼠室管膜下區(qū)神經發(fā)生的作用研究.pdf

1、室管膜下區(qū)（Subventricular zone，SVZ）是指沿著整個側腦室外側壁分布的區(qū)域。1912年Allen報道在成年大鼠SVZ存在著可分裂的細胞。60年代，Altman和Das研究發(fā)現(xiàn)在成年腦SVZ可產生新的神經元細胞。1993年，Lois和 Alvarez-Buylla運用成年嚙齒動物SVZ細胞在體外分離和培養(yǎng)出神經干細胞。90年代的研究推翻了長期以來認為神經細胞不能再生的觀念，進一步地證明在成年腦中存在神經發(fā)生（neuro

2、genesis）、神經干細胞存在于成年動物的中樞神經系統(tǒng)中。哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的神經發(fā)生通常發(fā)生在兩個部位，海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的顆粒下層（subgranular zone,SGZ）和SVZ。SVZ新生細胞沿著吻側遷移流（rostral migratory stream,RMS）遷移到嗅球（olfactory bulb，OB）并在那里分化為中間神經元。神經發(fā)生在成體SVZ持續(xù)存在，但是受很多諸如年齡、性別、激

3、素水平、環(huán)境因素等的影響，也受到帕金森病、癲癇、缺血性腦血管病、Alzhemeir’病等病理狀態(tài)的影響。 硫胺素（維生素B1）是一種水溶性的B族維生素，在體內作為α-酮戊二酸脫氫酶復合物（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KGDH）、丙酮酸脫氫酶復合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDH)和轉酮醇酶(transketolase，TK)的輔酶參與了三羧

4、酸循環(huán)和磷酸戊糖旁路反應。硫胺素對于維持腦的發(fā)育或成年腦的細胞氧化代謝以及核酸合成具有非常重要的作用。韋尼克腦病(Wernicke's disease，WE)是由于硫胺素缺乏（thiamine deficiency，TD）導致的神經退行性變，既往發(fā)現(xiàn)TD顯著抑制了海馬DG的SGZ的神經發(fā)生，且早期補充硫胺素對因TD所致的海馬神經發(fā)生缺陷有逆轉作用。然而,TD是否影響SVZ的神經發(fā)生尚不清楚，如果TD可對神經發(fā)生產生影響，那么補充硫胺素是

5、否能改善上述影響。 帕金森病(Parkinson’s diease，PD)是一種常見于中老年人的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌張力增高、運動減少和姿勢步態(tài)障礙。PD的主要病理特征是黑質致密帶多巴胺能神經元進行性缺失和死亡，使黑質紋狀體通路多巴胺（dopamine，DA）釋放減少，造成紋狀體DA-乙酰膽堿失平衡。既往發(fā)現(xiàn)，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3

6、,6-etrahydropyridine，MPTP)所致的PD小鼠模型SVZ的神經發(fā)生有所下調，也有文章報道PD病人腦脊液硫胺素水平有所下降。然而，硫胺素對MPTP小鼠模型下調的神經發(fā)生是否有改善作用不得而知。為此本課題分為兩部分進行。 第一部分、硫胺素缺乏及再補充對成年小鼠室管膜下區(qū)神經發(fā)生的作用研究 目的：探討硫胺素缺乏（TD）以及補充硫胺素對成年小鼠室管膜下區(qū)（SVZ）神經發(fā)生的影響。 方法：TD模型小鼠給

7、予TD飼料喂養(yǎng)，并按喂養(yǎng)時間分為7天組(TD7)，14天組(TD14)，21天組（TD21），正常對照組給予正常飼料喂養(yǎng)，按喂養(yǎng)時間亦分為7天組（Con7），14天組（Con 14），21天組（Con21）。對于TD7和TD14小鼠在TD飲食7天和14天后分別給予恢復正常飲食并給予腹腔注射硫胺素注射7天，并分別記為TD7＋7d組和TD14＋7d組。動物處死前5天腹腔給予5-溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU）

8、。用免疫熒光組化染色分別檢測SVZ的BrdU和雙皮質素(Doublecortin，Dcx)陽性細胞的分布和數(shù)目。 結果：正常組的BrdU和Dcx陽性細胞在SVZ均勻分布在側腦室背外側角，側腦室外側壁亦有少量分布，TD14和TD21組兩類陽性細胞的減少主要為側腦室背外側角。在TD14和TD21組，SVZ的BrdU標記陽性細胞數(shù)（TD14：74.97±7.75和TD21：67.27±10.91 pixels/mm2）明顯低于對照組(

9、Con14：122.30±8.86和Con21：122.99±5.33 pixels/mm2)，Dcx 標記陽性細胞數(shù)（TD14：1485.98±163.21和TD21：935.73±273.66 pixels/mm2）也明顯低于對照組(Con14：2359±155.68和Con21：2355±100.75 pixels/mm2)。TD7天時補充硫胺素7天（TD7＋7d組）的BrdU以及Dcx陽性細胞數(shù)較TD7相比有所上升（TD7＋7d

10、組BrdU：115.83±7.06，Dcx：2190.5±38.7 vs TD7 BrdU: 109.01±12.76，Dcx：2108.43±49.91 pixels/mm2），且較未補充的TD14組相比明顯增加（TD7＋7d組BrdU：115.83±7.06，Dcx：2190.5±38.7 vs TD14組BrdU：74.97±7.75,Dcx：1485.98±163.21 pixels/mm2）；在TD14天時開始補充硫胺素的TD

11、14＋7d組BrdU以及Dcx陽性細胞數(shù)較TD14相比有所下降（TD14＋7d組BrdU：70.11±3.05，Dcx：1255.9±287.8 vs TD14組BrdU：74.97±7.75，Dcx：1485.98±163.21 pixels/mm2），且與TD21組相比，其BrdU以及Dcx陽性細胞數(shù)無明顯變化（TD14＋7d組BrdU：70.11±3.05，Dcx：1255.9±287.8 vs TD21組BrdU：67.27±1

12、0.91，Dcx：935.73±273.66 pixels/mm2）。 結論：TD可阻礙成年小鼠SVZ的神經發(fā)生。早期補充硫胺素可能使TD模型小鼠的神經發(fā)生增加。 第二部分、硫胺素對帕金森病模型小鼠室管膜下區(qū)神經發(fā)生的作用研究 目的：探討補充硫胺素對PD模型小鼠SVZ神經發(fā)生的影響。 方法：PD模型組（PD組）為小鼠給予腹腔注射MPTP（一天之內連續(xù)注射4次，兩次注射之間間隔為2小時，注射量為每次20mg

13、/kg），注射MPTP前后各給予正常飲食飼養(yǎng)7天。硫胺素干預組（PDT）為給予正常小鼠腹腔注射硫胺素（劑量100mg/kg.d× 7天），至第8天時給予腹腔注射MPTP，同時繼續(xù)注射硫胺素，MPTP和硫胺素注射方法同前，第9天停止注射MPTP，予以繼續(xù)按上述方法注射硫胺素7天。Con組為PD對照組，予以等體積0.9％生理鹽水代替MPTP注射。ConT組為PDT對照組，硫胺素注射方法同PDT組，用等體積0.9％生理鹽水注射代替MPTP注射

14、。動物處死前5天腹腔給予BrdU。用免疫熒光組化染色分別檢測SVZ的BrdU和Dcx陽性細胞的分布和數(shù)目。 結果：Con組的BrdU陽性細胞和Dcx陽性細胞在SVZ均勻分布在側腦室背外側角，側腦室外側壁亦有少量分布，PD組BrdU與Dcx陽性細胞減少主要為側腦室背外側角，PD動物注射硫胺素后（PDT組）BrdU和Dcx陽性細胞在背外側角明顯增加。PD組SVZ的 BrdU和Dcx陽性細胞與Con組相比數(shù)量顯著減少（PD組BrdU：

15、89.3±8.89，Dcx：1507±105.67 vs Con組BrdU：123.2±10.09，Dcx：2341±112.38 pixels/mm2），PDT組SVZ的 BrdU和Dcx陽性細胞數(shù)量顯著增加（PDT組BrdU: 116.5±11.56，Dcx: 1964±89.89 vs PD組BrdU: 89.3±8.89，Dcx: 1507±105.67 pixels/mm2）。 結論：PD動物模型小鼠SVZ神經發(fā)生明顯