Functional Analysis of Nicotiana sylvestris CBL Family Gene NsylCBL2.pdf

1、類(lèi)鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基蛋白（CBL）是植物中普遍存在的一種鈣感受器家族。很多研究表明CBL在植物響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫中起著至關(guān)重要的作用。因此，它被認(rèn)為是基因抗逆育種工作中很重要的候選基因。
　　本研究旨在從林煙草中分離CBL基因并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。主要工作內(nèi)容如下：
　　1.利用同源克隆的策略，從林煙草的葉片中獲得一個(gè)基因。進(jìn)化樹(shù)分析表明該基因與其它物種中的CBL2基因在同一個(gè)分支上。因此將其命名為林煙草CBL2基因。多序

2、列比對(duì)分析表明林煙草CBL2蛋白與擬南芥CBL2蛋白的序列相似度高達(dá)89.38％，與楊樹(shù)、水稻和玉米CBL2蛋白的序列相似度分別為86.22%、84.00%、48.21%。
　　2. NsylCBL2的CDS序列全長(zhǎng)為675 bp，編碼一個(gè)由223個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其基因組包括7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子。NsylCBL2的4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)之間的距離分別為23、25和32個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明NsylCBL2的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與

3、其它物種中CBL2相似。
　　3.通過(guò)浸花法將NsylCBL2轉(zhuǎn)入擬南芥中，對(duì)T1代植株進(jìn)行RCR陽(yáng)性鑒定和RT-PCR表達(dá)量檢測(cè)，對(duì)T2和T3代植株進(jìn)行抗性篩選，T3代純合株系用來(lái)進(jìn)行NsylCBL2的功能驗(yàn)證，擬南芥cbl2突變體從TAIR上訂購(gòu)并進(jìn)行了T-DNA插入驗(yàn)證。
　　4.已有研究表明CBL2基因參與鹽和鎂的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此本試驗(yàn)也進(jìn)行了高鹽和高鎂處理，來(lái)檢測(cè)NsylCBL2是否也具有這樣的功能。但是萌發(fā)、表型觀

4、察和生理數(shù)據(jù)表明過(guò)表達(dá)NsylCBL2擬南芥植株、突變體與野生型在這些處理下沒(méi)有明顯差異。因此， NsylCBL2可能不參與鹽與鎂的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　5.另一方面，pCHF3-NsylCBL2這個(gè)質(zhì)粒通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法侵染到煙草里面。過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草就已經(jīng)獲得，并且表達(dá)量水平高于普通煙草。從轉(zhuǎn)基因煙草收到種子后做特定的抗性篩選檢測(cè)測(cè)試，獲得符合3:1比例的T1代，然后種到溫室獲得T2代，供以后的實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　6.獲得NsylC