雷公藤甲素對(duì)APP-PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬內(nèi)老年斑形成和炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景:阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的腦內(nèi)病變是一個(gè)慢性炎癥的觀點(diǎn)，已經(jīng)普遍被人們接受。AD 腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)的特征包括：與β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積和老年斑(senile plaques，SP)形成有關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，以及補(bǔ)體成份和致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加等。非甾體類抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatory drugs，NSAI

2、Ds)不僅可以降低AD發(fā)生的危險(xiǎn)性，而且可以延緩AD的進(jìn)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，NSAIDs可以抑制AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積和SP的形成，并抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生以及IL-1β等致炎性細(xì)胞因子的表達(dá)與分泌。因此，抗炎治療AD具有重要的價(jià)值。但是，由于NSAIDs嚴(yán)重的毒副作用，可能限制其在臨床上的使用。 雷公藤甲素(triptolide，T10)是中藥雷公藤提取物的有效成份之一，具有抗炎和免疫抑制的作用

3、，臨床上被應(yīng)用于治療風(fēng)濕和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫和炎癥反應(yīng)性疾病。不少的體外研究證實(shí)，雷公藤甲素的抗炎和免疫抑制效應(yīng)是通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)如IL-1β、TNFα等的表達(dá)釋放和抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。最近的研究表明，雷公藤甲素具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以保護(hù)中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元免受脂

4、多糖(lipopolysaccharide，LPS)的損傷，其機(jī)制可能與雷公藤甲素抑制LPS所致的小膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及抑制LPS所致的炎癥反應(yīng)有關(guān)。T10對(duì)AD腦內(nèi)炎癥和免疫反應(yīng)影響的研究，到目前為止還少見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究首次用T10 處理β-淀粉樣前體蛋白(β-Amyloid precursor protein，APP)基因和早老素Ⅰ(Presinilin 1，PS1)基因雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠(APP/PS1dtg)，研究T10對(duì)A

5、PP/PS1 dtg的影響，探討T10治療AD的可能性及其可能機(jī)制，為AD的防治提供新的方法。 目的:研究雷公藤甲素(T10)對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬內(nèi)Aβ沉積與SP形成、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化以及COX-2誘導(dǎo)表達(dá)的影響及其可能機(jī)制，為T10防治AD提供新的理論依據(jù)。 方法: 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取18只4.5月齡健康雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，隨機(jī)分為3組，分別腹腔注射5 μg/k

6、g.d T10(T10 H組)、1μg/kg.d T10(T10 L 組)和等容量的溶媒(PLC組)共計(jì)45天；另取5只野生型非轉(zhuǎn)基因同齡雄性小鼠，不作任何處理作為對(duì)照。45天后取材，左側(cè)半大腦用于組織學(xué)染色，右側(cè)半大腦用于蛋白分析。組織學(xué)研究：按無(wú)偏性體視學(xué)(Urnbiased stereology)SUR 原則(Systematic-Uniform-Random principle)，每10片取1片收集切片，6E10、GFAP、MA

7、C1、COX-2免疫組織化學(xué)方法染色結(jié)合無(wú)偏性體視學(xué)定量分析研究Aβ、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和COX-2等的變化，剛果紅染色顯示老年斑形成的改變，6E10與GFAP、6E10與MAC1、COX-2 與 GFAP、COX-2 與MAC1等免疫熒光雙標(biāo)記顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞與Aβ和COX-2等的關(guān)系。Western Blot蛋白分析海馬Aβ和COX-2等蛋白水平的變化。 2.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：(1)培養(yǎng)A172人星形膠質(zhì)細(xì)胞，

8、分別用0.2、1 和5μg/L T10預(yù)處理A172細(xì)胞1 h，隨后用1mg/L LPS處理細(xì)胞3h 和 6h，逆轉(zhuǎn)錄-PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR)、western blot研究不同濃度T10對(duì)LPS所致COX-2 表達(dá)的影響：電泳遷移率檢測(cè)(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)研究T10對(duì)LPS所致的NF-κB/DNA 結(jié)合活性的影響。(2)

9、培養(yǎng)高表達(dá)人類COX-2蛋白(hCOX-2)的sf-9細(xì)胞系，分別用T10、COX-2酶活性抑制劑NS398和吲哚美辛處理細(xì)胞，放射免疫(Radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)培養(yǎng)液中PGE2的含量，研究T10對(duì)COX-2酶活性的影響。 結(jié)果: 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)T10處理APP/PS1 dtg 45 d，①可以抑制Aβ在海馬的沉積，減少SP的形成。無(wú)偏性體視學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)，與PLC組的6E10陽(yáng)

10、性的Aβ斑的總面積比較，T10 H組海馬Aβ斑的總面積減少了35％(P<0.001)，T10 L組海馬Aβ斑的總面積減少了18％(P<0.05)。此外，T10 H組較T10 L組減少了21％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②western Blot蛋白分析也顯示，海馬內(nèi)T10 H組Aβ蛋白水平最低，PLC組Aβ蛋白水平最高，T-10 L組Aβ蛋白水平介于二者之間；③T10還可以減少6E10陽(yáng)性的神經(jīng)元的數(shù)量；④T10可以抑制沉積的A

11、β聚集和纖維化，減少SP的形成。無(wú)偏性體視學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)，與PLC組的剛果紅陽(yáng)性SP比較，T10 H組海馬SP總面積減少了32％(P<0.001)，T10 L組海馬SP總面積減少了21％(P<0.05)。 (2)T10可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化與增生：①T10可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與增生，減少小膠質(zhì)細(xì)胞團(tuán)簇的面積，無(wú)偏性體視學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)，與PLC組比較，T10 H組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)減少了30％(P<0.01)，T10 L組

12、減少18％(P<0.05)；T10 H組較T10 L組減少17％(P<0.05)。②T10可以抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少GFAP的表達(dá)以及抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，無(wú)偏性體視學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)，與PLC組比較，T10 H組海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)減少了20％(P<0.01)，T10 L 組減少13％(P>0.05)。 (3)T10可以抑制APP/PS1 dtg AD模型小鼠海馬內(nèi)COX-2的表達(dá)/活化：①T10抑制COX-2 在 APP/

13、PS1 dtg海馬神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)/活化，減少 COX-2陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量；②野生型小鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)COX-2，但在APP/PS1 dtg小鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)COX-2，T10 處理45天后，海馬內(nèi)COX-2陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)分別減少28％(T10 H，P<0.01)和12％(T10 L，P>0.05)；③westernblot蛋白分析顯示，PLC 組海馬COX-2蛋白水平最高，其次為野生型小鼠，T10 H組海馬內(nèi)CO

14、X-2蛋白水平最低。 2.細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果： (1)LPS刺激培養(yǎng)的A172人星形膠質(zhì)細(xì)胞，可以導(dǎo)致COX-2表達(dá)增加，PGE2產(chǎn)生增加，T10呈劑量依賴性降低COX-2的表達(dá)和PGE2的產(chǎn)生； (2)T10對(duì)高表達(dá)hCOX-2的sf-9細(xì)胞系COX-2酶活性沒(méi)有影響，提示T10對(duì)COX-2的抑制發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平； (3)LPS 刺激培養(yǎng)的A172人星形膠質(zhì)細(xì)胞可以引起NF-κ/p50/P65 DNA結(jié)合活性明

15、顯增高，T10呈劑量依賴性抑制NF-κ結(jié)合活性。 結(jié)論: 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，T10可以抑制APP/PS1 dtg小鼠海馬內(nèi)Aβ的沉積與纖維化形成SP，并且抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化與增殖以及抑制活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)COX-2。說(shuō)明T10具有NSAIDs的部分特性，對(duì)該模型小鼠或AD腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用，或可用于AD的預(yù)防和治療。由于T10沒(méi)有NSAIDs 的毒副作用，因而可能在一定程度上優(yōu)于N