趨化因子CXCL12及受體CXCR4與卵巢上皮性癌生長與侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、卵巢惡性腫瘤占女性全身腫瘤死因順位的第五位，在婦科腫瘤中占首位。人類卵巢上皮性癌占卵巢惡性腫瘤的90％，其5年生存率僅為25％-30％，因此卵巢上皮性癌(以下簡稱卵巢癌)是婦科腫瘤領(lǐng)域威脅女性生命的第一殺手。卵巢癌獨特的生長和轉(zhuǎn)移規(guī)律是廣泛地轉(zhuǎn)移至腹膜、隔膜和大網(wǎng)膜，最終由于盆、腹腔的廣泛播散而導(dǎo)致患者死亡。因此卵巢癌治療失敗和死亡的主要原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移播散。探索腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對改善病人預(yù)后至關(guān)重要。但腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)分子，如生長因子

2、、粘附因子、化學(xué)吸引分子一直不被人們認(rèn)識。2001年Muller等對乳腺癌和黑色素瘤進(jìn)行了一系列趨化因子及其受體的研究，使人們認(rèn)識到癌細(xì)胞的趨化性轉(zhuǎn)移可能受CXCL12-CXCR4軸調(diào)節(jié)。以前研究證實趨化因子CXCL12及其受體CXCR4調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移和造血干細(xì)胞的歸巢。在腫瘤組織中表達(dá)最普遍為CXCR4。本課題是從臨床到基礎(chǔ)，層次遞進(jìn)的系列研究，包括CXCL12和CXCR4表達(dá)的臨床意義、細(xì)胞體外實驗和體內(nèi)動物實驗，旨在探討CXCL

3、12和CXCR4表達(dá)與臨床病理特征、腫瘤惡性侵襲行為和預(yù)后的關(guān)系，以及CXCL12-CXCR4軸對腫瘤轉(zhuǎn)移過程中多個重要步驟的影響和CXCR4拮抗劑AMD3100對體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用，從而加深對卵巢癌生物學(xué)行為的理解，為CXCR4抑制劑用于卵巢癌的治療提供理論依據(jù)。 方法：課題分為三部分： 1趨化因子CXCL12及受體CXCR4在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。采用免疫組化SP法檢測6例正常卵巢表面上皮、17例

4、良性上皮性卵巢腫瘤、10例交界性上皮性卵巢腫瘤、44例卵巢上皮性癌原發(fā)灶和30例相應(yīng)大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶組織中的CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測12例上述卵巢上皮性癌原發(fā)灶組織的CXCL12和CXCR4mRNA表達(dá)，以及5例正常腹膜和12例卵巢癌腹膜的CXCL12mRNA表達(dá)。分析卵巢上皮性癌組織中CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤病理類型、手術(shù)病理分期、病理分化、術(shù)后殘余灶大小、

5、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹水、CA125下降等臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系。 2CXCL12-CXCR4軸對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和分泌的體外實驗研究。人卵巢腺癌細(xì)胞株CAOV-3、3AO和SKOV3細(xì)胞體外培養(yǎng)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測3種細(xì)胞CXCR4蛋白表達(dá)，采用RT-PCR技術(shù)檢測3種細(xì)胞CXCL12和CXCR4mRNA表達(dá)。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法，判斷在無血清培養(yǎng)液的生長條件下，不同濃度的CXCL12對CAOV-3和3

6、AO細(xì)胞增殖的影響，以及CXCR4中和抗體或拮抗劑AMD3100的抑制作用。以Transwell侵襲小室為模型，應(yīng)用Matrigel探討不同濃度的CXCL12和腹水對CAOV-3和3AO細(xì)胞遷移、侵襲的影響，以及CXCR4中和抗體或拮抗劑AMD3100對此的抑制作用。采用RT-PCR技術(shù)判斷CAOV-3和3AO細(xì)胞整合素β1和VEGF-CmRNA表達(dá)，以及CXCL12作用后不同時間兩者的變化。 3荷人卵巢癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型

7、的建立及實驗。人卵巢腺癌細(xì)胞株CAOV-3體外培養(yǎng)。將裸鼠分為A、B兩組。1×107CAOV-3細(xì)胞接種于裸鼠左肋背部皮下，3小時后A組腹腔注入CXCR4拮抗劑AMD3100。2周左右待移植瘤長徑達(dá)0.7-1cm時，將B組隨機(jī)分為B1和B2兩組，B1組腹腔內(nèi)注入PBS，B2組腹腔注入AMD3100，觀察三組移植瘤體積的變化，計算抑瘤率。 結(jié)果： 1正常卵巢表面上皮細(xì)胞無CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)，但兩者共表達(dá)在卵巢

8、皮質(zhì)的卵泡細(xì)胞。17例卵巢良性上皮性腫瘤CXCL12和CXCR4蛋白陽性率分別為100％和88％；10例卵巢交界性上皮性腫瘤CXCL12和CXCR4蛋白陽性率均為90％，在卵巢良性和交界性上皮腫瘤中CXCL12陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，CXCR4為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。正常腹膜有CXCL12mRNA表達(dá)，其表達(dá)量與癌腹膜相近，顯著低于癌組織(P＜0.05)。12例卵巢上皮性癌組織均有CXCL12(1.13±0.12)和CXCR4(

9、0.9±0.1)mRNA表達(dá)，44例卵巢上皮性癌原發(fā)灶的CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)陽性率分別為91％和59％。CXCL12陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)著色；在26例CXCR4陽性表達(dá)腫瘤中，僅1例為細(xì)胞核著色，其余為細(xì)胞質(zhì)著色。原發(fā)灶的CXCR4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，但將原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的CXCR4表達(dá)相結(jié)合，CXCR4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P=0.018)。CXCL12表達(dá)強(qiáng)度與術(shù)中腹水量呈顯著相關(guān)(P=0.014)。難治復(fù)發(fā)組的CX

10、CR4陽性率(81％)顯著高于無復(fù)發(fā)組(28％，P=0.001)。單因素分析顯示：CXCR4陽性表達(dá)的患者中位數(shù)腫瘤無進(jìn)展生存時間和總生存時間(15個月、27個月)明顯短于CXCR4陰性表達(dá)者(＞21個月、＞32個月，分別為P＜0.001和0.017)。多因素分析顯示：CXCR4表達(dá)和殘余灶大小是影響卵巢上皮性癌患者腫瘤無進(jìn)展生存時間和總生存時間的獨立預(yù)后因素。 2CAOV-3卵巢癌細(xì)胞有CXCR4mRNA和蛋白表達(dá)，無CXCL

11、12mRNA表達(dá)。在100ng/mlCXCL12作用下，CXCR4mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。3AO細(xì)胞有極弱的CXCR4mRNA和蛋白表達(dá)。在無血清的亞最佳生長條件下，培養(yǎng)第1、2、3天，100ng/mlCXCL12可明顯刺激CAOV-3和3AO細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，而10ng/mlCXCL12對CAOV-3和3AO細(xì)胞的增殖與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)；100ng/mlCXCL12對細(xì)胞的增殖作用能被10u

12、g/mlCXCR4中和抗體或1ug/mlAMD3100所抑制；在沒有CXCL12的作用下，單純的10ug/mlCXCR4中和抗體不能抑制細(xì)胞的增殖。CXCL12對CAOV-3和3AO細(xì)胞的遷移有明顯的趨化性，隨CXCL12濃度的增加遷移的細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)，并被10ug/mlCXCR4中和抗體或1ug/mlAMD3100所抑制。腹水對CAOV-3細(xì)胞的遷移作用顯著強(qiáng)于CXCL12(P＜0.05)，并不被CXCR4中和抗體和V

13、EGF中和抗體所抑制。CXCL12對3AO細(xì)胞的遷移作用程度小于CAOV-3細(xì)胞。在無血清培養(yǎng)液作為對照時，CAOV-3穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)很少；10ng/mlCXCL12使CAOV-3穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)增多(P＜0.05)，100ng/mlCXCL12使CAOV-3穿過Matrigel的細(xì)胞數(shù)顯著增多，其水平超過10ng/mlCXCL12(P＜0.05)，表明隨CXCL12濃度增加細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，這種侵襲能被10ug

14、/mlCXCR4中和抗體或1ug/mlAMD3100抑制。卵巢癌腹水使CAOV-3穿過Matrigel細(xì)胞明顯增多，其水平超過100ng/mlCXCL12(P＜0.05)，并且不被CXCR4中和抗體和VEGF中和抗體所抑制。CXCL12不能促進(jìn)3AO細(xì)胞穿過Matrigel。CAOV-3細(xì)胞有整合素β1(0.534±0.1)和VEGF-CmRNA(0.524±0.09)表達(dá)。100ng/mlCXCL12作用后3小時整合素β1mRNA表達(dá)

15、顯著增加(1.527±0.16)(P＜0.05)，24小時維持高水平。100ng/mlCXCL12作用后8小時VEGF-CmRNA表達(dá)開始增多(0.803±0.1)，24小時顯著增加(1.107±0.15)(P＜0.05)。3AO細(xì)胞無VEGF-C和整合素β1mRNA表達(dá)，CXCL12作用后24小時內(nèi)未能誘導(dǎo)VEGF-C和整合素β1mRNA表達(dá)。 3B1組(對照組)裸鼠皮下移植瘤生長速度最快。實驗結(jié)束時，A組(成瘤前腹腔注入AM

16、D3100)移植瘤體積顯著小于B1和B2(成瘤后腹腔注入AMD3100)組(P＜0.01)，B1組移植瘤體積顯著大于B2組(P＜0.01)。B2組抑瘤率為66.11％。B1組移植瘤表面充血，新生血管生成明顯。 結(jié)論：CXCR4在卵巢上皮性癌中的表達(dá)陽性率較高，是影響其預(yù)后的獨立指標(biāo)之一。體外實驗證實CXCL12可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、分泌整合素β1和VEGF-C，并被CXCR4中和抗體或拮抗劑AMD3100抑制，表明CXC