爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系的建立及其表達(dá)的NMDA受體藥理學(xué)特性的研究.pdf

1、目的：作為異源性表達(dá)載體，非洲爪蟾卵母細(xì)胞用于各種蛋白的表達(dá)，包括受體、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體等，為研究所表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及藥理學(xué)特性提供了重要的手段。本實(shí)驗(yàn)旨在建立爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系，并進(jìn)一步研究所要表達(dá)的NMDA受體蛋白的結(jié)構(gòu)及功能。 方法：在去除濾泡膜的非洲爪蟾卵母細(xì)胞上，建立雙電極電壓鉗記錄技術(shù)，并使用該技術(shù)觀察爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)源性遞質(zhì)門(mén)控性和電壓門(mén)控性離子通道電流。將所研究的NMDA受體亞單位NR-1A、NR-2A

2、、NR-2B的cDNA分別體外轉(zhuǎn)錄為cRNA后，將其射到爪蟾卵母細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。采用雙電極電壓鉗技術(shù)證實(shí)NR-1A/NR-2A和NR-1A/NR-2B受體的功能性表達(dá)。并對(duì)所表達(dá)的NMDA受體不同亞型的藥理學(xué)特性進(jìn)行了研究。 結(jié)果：灌流液中分別加入NMDA受體、γ-氨基丁酸和煙堿受體激動(dòng)劑，均未能在未注射外源性cRNA的爪蟾卵母細(xì)胞上誘發(fā)出電流。去極化刺激僅可誘發(fā)出一外向電流。將NR-1A/NR-2A、NR-1A/NR-2B分別注

3、入爪蟾卵母細(xì)胞后，灌流液中加入NMDA受體激動(dòng)劑L-谷氨酸和甘氨酸可在卵母細(xì)胞上誘發(fā)出內(nèi)向電流，其中注射過(guò)2B亞單位激活的電流可被2B選擇性拮抗劑氟哌啶醇阻斷，而對(duì)注射過(guò)2A亞單位激活的電流作用不明顯。胍丁胺和苯環(huán)壬酯手性化合物能可逆性阻斷NMDA受體(NR-1A/NR-2A、NR-1A/NR-2B)電流，其中胍丁胺的阻斷作用除具有電壓依賴(lài)性外還有濃度依賴(lài)性。 結(jié)論：成功建立了爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)體系，并使用雙電極電壓鉗記錄技術(shù)，對(duì)