小鼠GV期卵母細(xì)胞的研究——核質(zhì)比、ATP8表達(dá)及其RNAi載體構(gòu)建.pdf

1、目的：1、分析小鼠卵巢生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)期卵母細(xì)胞的核質(zhì)比，探討核質(zhì)比在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育中的作用；2、分析GV期卵母細(xì)胞線粒體ATP合酶亞基8(ATP8)的表達(dá)及其生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，研究卵母細(xì)胞成熟與線粒體功能的關(guān)系；3、構(gòu)建ATP8基因的RNA干擾載體，為研究ATP8基因在卵母細(xì)胞成熟發(fā)育過程中的作用及其對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育參數(shù)-核質(zhì)比的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。 方法：1、用擠壓法從卵巢中分離獲得GV期卵母細(xì)胞并置

2、leica Mps 60倒置顯微鏡下拍照，測(cè)量系統(tǒng)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)圖片校正后，測(cè)量GV期卵母細(xì)胞面積和半徑，按核質(zhì)比(nucleus-plasma ratio，NP)公式：NP=V<,N>/(V<,c>-V<,N>)，式中V<,N>為核的體積，V<,c>為細(xì)胞的體積，由V=4/3pr<'3>分別求得，計(jì)算出GV期卵母細(xì)胞的核質(zhì)比；2、以Genbank(NC 005089)公布的線粒體ATP8序列為參考，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，用RT-PCR檢測(cè)GV期單個(gè)卵

3、母細(xì)胞中ATP8基因的表達(dá)：其中，cDNA的合成分兩種方法進(jìn)行：一是將GV期單個(gè)卵母細(xì)胞直接進(jìn)行RT合成cDNA，二是先用DNA酶加EcoR Ⅰ酶祛除mtDNA和核DNA后再進(jìn)行RT；回收產(chǎn)物構(gòu)建克隆質(zhì)粒并測(cè)序；3、用Blastn、VECTOR NIT 9.0、RNAdraw、 Treeview等工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上用RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子表達(dá)siRNA法構(gòu)建ATP8的RNA干擾載體。 結(jié)果：1、分離獲得G

4、V期卵母細(xì)胞51枚，測(cè)得卵徑為40.940±3.341 μm，核徑為15.020±2.236μm，其核質(zhì)比為0.054±0.019；2、RT-PCR結(jié)果顯示ATP8基因在GV期卵母細(xì)胞中表達(dá)。克隆測(cè)序顯示所測(cè)昆明小鼠ATP8序列與Genbank序列完全一致；3、blastp序列比對(duì)和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖均顯示12種動(dòng)物間的ATP8氨基酸序列和ATP8核酸序列有較大差異，其中不同品種小鼠問也有差異；4、不同物種ATP8核苷酸序列構(gòu)建出的分子

5、進(jìn)化樹中，小鼠與棕熊進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，與田鼠、家貓進(jìn)化距離相對(duì)較近。5、設(shè)計(jì)ATP8基因干擾序列并且重組質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶和測(cè)序鑒定，表明成功構(gòu)建了pGPH1/GFP/Neo-mouse-shATP8 RNA干擾質(zhì)粒。 結(jié)論：1、本文測(cè)得小鼠GV期卵母細(xì)胞的核質(zhì)比為0.054±0.019，與文獻(xiàn)報(bào)道其它物種同時(shí)相核質(zhì)比在相同范圍內(nèi)，提示核質(zhì)比是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的重要指標(biāo)；2、線粒體ATP8基因在GV期卵母細(xì)胞中有表達(dá)，提示Gv期卵