小鼠18S rRNA基因在卵巢和卵母細(xì)胞中的表達(dá)及其RNAi載體構(gòu)建.pdf

1、目的:檢測(cè)小鼠18S rRNA基因在卵巢及單個(gè)GV期、M Ⅰ期卵母細(xì)胞中的表達(dá)，揭示核糖體18S rRNA基因與小鼠卵母細(xì)胞成熟之間的關(guān)系。分析小鼠18S rRNA生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建其RNA干擾載體，為研究其在早期胚胎發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法:根據(jù)Genbank中已公布的小鼠18S rRNA保守區(qū)核酸序列(363bp)，用DNAclub軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，RT-PCR分別檢測(cè)卵巢和單個(gè)GV期、M Ⅰ期卵母細(xì)胞18

2、s rRNA的表達(dá)；將單個(gè)M Ⅰ期卵母細(xì)胞中獲得的目的片段連接至pTG19-T載體、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，用RNAdraw、VECTOR NIT 9.0、ClutalX 1.81、Treeview等軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析；同時(shí)用載體表達(dá)法構(gòu)建18S rRNA干擾載體。 結(jié)果:①通過(guò)RT-PCR檢測(cè)顯示18s rRNA基因在小鼠卵巢組織和單個(gè)GV期、M Ⅰ期卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，且在未成熟卵母細(xì)

3、胞中，M Ⅰ期的表達(dá)明顯強(qiáng)于GV期的表達(dá)； ②RT-PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果顯示：昆明小鼠18s rRNA基因保守區(qū)序列與基因庫(kù)序列[MR＿003278保守區(qū)部分(791bp～1153bp)]完全一致；Blastn比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在不同物種中差異較小，選出14種生物18S rRNA全序列經(jīng)VECTOR NIT 9.0軟件分析，提示昆明小鼠18S rRNA與牛、人類、刺猬、中國(guó)倉(cāng)鼠、豬、犰狳、褐鼠、兔子、馬、食蟹猴、負(fù)鼠、短尾猊、袋熊

4、的18S rRNA的相似率依次為67％，100％，100％，36％，100％，100％，67％，100％，100％，92％，99％，99％，99％；Clustal 1.81和Treeview構(gòu)建出的分子進(jìn)化樹表明:在上述14種生物中昆明小鼠與中國(guó)倉(cāng)鼠進(jìn)化關(guān)系最近，與兔子、豬聚成一簇，與食蟹猴進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)；③根據(jù)18S rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并合成RNA干擾寡核苷酸片段，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶及測(cè)序表明成功構(gòu)建了pGPH1/GFP/Neo

5、-mouse-sh 18S rRNA干擾表達(dá)質(zhì)粒。 結(jié)論:①小鼠18s rRNA在卵巢及未成熟卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，且在M Ⅰ期的卵母細(xì)胞中表達(dá)明顯強(qiáng)于GV期的卵母細(xì)胞，提示小鼠M Ⅰ期之后的卵母細(xì)胞發(fā)育需要蛋白質(zhì)的合成，卵母細(xì)胞的成熟可能與核糖體18S基因表達(dá)有關(guān)；②質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)序列兩兩比對(duì)顯示：小鼠18S rRNA基因保守區(qū)變異小，在進(jìn)化上是非常保守的；③14種生物分子進(jìn)化樹分析結(jié)果反映了小鼠18S rRNA基因與中國(guó)