CTE-RHA復(fù)合核酶的構(gòu)建及抑制HCV RNA復(fù)制和相應(yīng)蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需的真核表達(dá)載體，特別是人源性tRNA val啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)CTE介導(dǎo)的核酶高效表達(dá)載體pPHCV5-CR以及對應(yīng)的無CTE介導(dǎo)的載體pPHCV5．R；建立HCV Subgenomie Replieon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)的細(xì)胞株；探討核酶和核酶．CTE復(fù)合物對丙型肝炎病毒亞基因組的影響，進(jìn)一步探討丙型肝炎治療研究方向。 研究方法: 1、構(gòu)建相應(yīng)的核酶載體合成CTE-DNA，設(shè)計(jì)、構(gòu)建含tRNAval啟動(dòng)子的核酶和

2、帶有CTE的含tRNAval啟動(dòng)子的核酶。 2、建立HCV Subgenomic Replieon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)的細(xì)胞株在脂質(zhì)體lipofectamine<'TM>2000介導(dǎo)下，將含有HCV Subgenes的真核表達(dá)質(zhì)粒pHCV BM4-5導(dǎo)入人肝癌細(xì)胞系QSR7701中，經(jīng)G418篩選抗性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立轉(zhuǎn)染克隆細(xì)胞系。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法證實(shí)轉(zhuǎn)染成功及其蛋白表達(dá)。 3、觀察四種質(zhì)粒

3、pPHCV5-R1、pPHCV5-R2、pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2對HCV Subgenomic Replicon穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)的細(xì)胞株中HCV RNA和相應(yīng)病毒蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1、經(jīng)測序后證實(shí)，成功構(gòu)建相應(yīng)的核酶載體，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2、經(jīng)RT-PCR和Western Blot證實(shí)，成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCVSubgenomic Replicon和表達(dá)的細(xì)胞株。 3、用構(gòu)建的普通核

4、酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和復(fù)合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含HCV亞基因復(fù)制子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染QSG7701細(xì)胞株，48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和WesternBlot，RT-PCR(以β-actin為內(nèi)對照)結(jié)果顯示：pPHCV5．CRl轉(zhuǎn)染組未見明顯擴(kuò)增目的條帶，pPHCV5-R1轉(zhuǎn)染組可見擴(kuò)增目的條帶，亮度低于未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；pPHCV5-CR2轉(zhuǎn)染組可見擴(kuò)增目的條帶，亮度低于未轉(zhuǎn)

5、染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，pPHCV5-R2轉(zhuǎn)染組可見擴(kuò)增目的條帶，亮度與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組接近。這些提示：復(fù)合核酶(帶有CTE)在細(xì)胞內(nèi)的切割靶RNA的效率明顯高于普通核酶。普通核酶難以切割的位點(diǎn)，復(fù)合核酶能進(jìn)行有效的切割；普通核酶能進(jìn)行切割的位點(diǎn)，帶CTE-核酶的切割效率明顯提高。WesternBlot(以β-actin為內(nèi)對照)結(jié)果顯示：應(yīng)用軟件分析各組細(xì)胞目的蛋白表達(dá)量無明顯差異，可能與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染作用時(shí)間短、蛋白表達(dá)變化不明顯，也可