RNA干擾抑制草魚呼腸孤病毒復(fù)制的細(xì)胞模型.pdf

1、草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖對象。草魚出血病是草魚最為嚴(yán)重的疾病之一，死亡率高達(dá)90％，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對該病尚缺乏有效的防治方法。
　　 RNA干擾（RNAinterference,RNAi）是指小的RNA干擾分子(Small interferingRNA,siRNA)特異性地抑制同源基因的表達(dá)，它是廣泛存在于生物中的一種基因沉默現(xiàn)象。由于RNAi具有高度特異性和高效性，

2、可以作為抑制特定基因表達(dá)的工具。
　　 本研究利用RNAi技術(shù)，在草魚腎臟細(xì)胞系(Ctenopharyngodon idellus Kidney,CIK)上建立抑制草魚呼腸孤病毒(Grass Carp Reovirus, GCRV)復(fù)制的模型，以期為定向抗病毒草魚分子育種技術(shù)研究奠定前期基礎(chǔ)。本論文主要進(jìn)行了以下幾個方面的研究：
　　 1.在CIK細(xì)胞上大量增殖GCRV病毒，提取病毒的核酸，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA

3、為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆測序，得到GCRV的部分基因片段序列。
　　 2.采用化學(xué)合成法分別合成靶向草魚呼腸孤病毒RNA分段基因組L2片段上的RNA聚合酶基因(RdRp)和S10片段上的外衣殼蛋白基因(OCP)的小干涉RNA分子siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117。用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染CI

4、K細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后用GCRV感染細(xì)胞，48h后收集感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，測定病毒TCID50/0.1mL值。Trizol試劑盒提取感染細(xì)胞的總RNA，以細(xì)胞管家基因β-actin mRNA水平為參照，采用RT-PCR檢測呼腸孤病毒siRNAs靶基因的mRNA水平。病毒滴度測定結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后細(xì)胞培養(yǎng)液的病毒滴度分別為104.41±0.16、103.83±0.

5、44和101.94±0.42,極顯著低于病毒感染陽性對照組的病毒滴度（107.92±0.52,p＜0.01），轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照組的病毒滴度為107.50土0.17，與病毒感染陽性對照相比，差異不顯著(p＞0.05)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示：與病毒感染陽性對照相比，轉(zhuǎn)染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后的CIK細(xì)胞中GCRV mRNA水平顯著下降(p＜0.01)，抑制率分別為82

6、.08±2.15％、89.19±1.14％、92.96±0.17％，而轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照對GVRVmRNA的水平?jīng)]有顯著的影響(p＞0.05)。結(jié)論：針對RNA聚合酶基因和外衣殼蛋白基因設(shè)計并化學(xué)合成的siRNA特異、高效地抑制了草魚呼腸孤病毒的復(fù)制。
　　 3.針對GCRV RNA聚合酶基因和外衣殼蛋白基因的3個位點，設(shè)計并合成了長度為63bp、5’端磷酸化用于質(zhì)粒表達(dá)的3段含siRNA特異序列的寡聚脫氧核糖核苷酸正鏈和負(fù)