MEAN通過干擾TPB抑制HCV復(fù)制.pdf

1、目的：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，經(jīng)血液傳播、嗜肝性感染，引起急/慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前全球約有1.85億HCV感染者，感染率約為3％。每年新增感染者逾300萬，死亡約50萬。目前的療法成功率僅有45％左右，而且周期長，副作用大。迄今全球仍沒有HCV預(yù)防性疫苗，不能阻斷HCV的傳播。在今后相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)丙肝仍然是威脅人類健康的重要傳染病。因此積極尋找有效治療HCV的辦法

2、至關(guān)重要。多嘧啶序列結(jié)合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）作為一種普遍存在的多效應(yīng)細(xì)胞因子，與多種病毒的生命周期相關(guān)。在核內(nèi)參與前mRNA的選擇性剪接，在胞質(zhì)中調(diào)節(jié)包括HCV在內(nèi)的多種病毒的翻譯和復(fù)制過程。因此，PTB在HCV RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用。本研究擬用JC1-Luc嵌合病毒感染Huh7.5.1細(xì)胞構(gòu)建HCV細(xì)胞模型，探討小分子化合物MEAN（6-methoxyet

3、hylamino-numonafide）對PTB質(zhì)核穿梭及HCV復(fù)制的影響。
　　方法：①96孔細(xì)胞芯片板中，濃度梯度（0，0.31，0.63，1.25，2.5，5，10，20μM）的MEAN作用Huh7.5.1細(xì)胞72 h，實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析(real time cellular analysis，RTCA)技術(shù)檢測MEAN的細(xì)胞毒性。HCV JC1質(zhì)粒體外制備HCV RNA轉(zhuǎn)錄體后轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，收集細(xì)胞上清再次孵育

4、Huh7.5.1細(xì)胞以建立HCV感染細(xì)胞模型（Huh7.5.1-JC1），感染后24 h給予濃度梯度（0，0.63，1.25，2.5，5，10μM）的MEAN處理細(xì)胞48 h后檢測熒光素酶水平判斷MEAN抗HCV效果。并通過Q-PCR和western blot分別檢測HCV RNA及核心蛋白(Core)的水平驗(yàn)證MEAN的抗HCV效應(yīng)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測Core蛋白進(jìn)一部驗(yàn)證MEAN對HCV感染的抑制效果。MEAN對E2突變株N415D和

5、G451R病毒復(fù)制的效應(yīng)以及MEAN與干擾素α（Interferonα，IFNα）、ITX5061及利巴韋林（Ribavirin，RBV）聯(lián)合藥效也通過檢測熒光素酶水平進(jìn)行評估。②HCV IRES雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞24 h后給予MEAN處理48 h后檢測雙熒光素酶水平研究MEAN對HCV IRES介導(dǎo)的翻譯的影響。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTB在HCV復(fù)制中的作用。此外，Q-PCR、western blot、免

6、疫熒光實(shí)驗(yàn)及異核體實(shí)驗(yàn)檢測MEAN對PTB表達(dá)水平及其胞核-胞質(zhì)穿梭的影響。mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MEAN對PTB mRNA穩(wěn)定性的影響。
　　結(jié)果：⑴熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN可以高效抑制JC1病毒復(fù)制(p＜0.05)，半數(shù)有效濃度(EC50)為2.36±0.29μM。⑵Q-PCR和western blot結(jié)果顯示MEAN劑量依賴性的抑制HCV RNA及核心蛋白水平(p＜0.05)，進(jìn)一步證實(shí)了MEAN對HCV復(fù)制的抑制效應(yīng)。⑶免

7、疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示MEAN可顯著減少Core+細(xì)胞。⑷熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN可以顯著抑制突變病毒N415D及G451R的復(fù)制，EC50分別為3.56±0.08和3.71±0.14μM。⑸藥物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MEAN與IFNα、ITX5061和RBV可協(xié)同抑制HCV的復(fù)制。⑹雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN對HCV IRES介導(dǎo)的翻譯抑制效果不明顯(p＞0.05)。⑺siRNA干擾PTB表達(dá)后，HCV復(fù)制水平顯著降低(p＜0.05)。⑻Q-PCR和W

8、estern Blot證實(shí)，HCV感染后PTB表達(dá)顯著升高;而MEAN可抑制其高表達(dá)(p＜0.05)。⑼mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN可縮短PTB mRNA半衰期。⑽western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)HCV感染后PTB的胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位增強(qiáng)，MEAN可抑制其胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位(p＜0.05)。⑾異核體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MEAN可抑制EGFP-PTB的胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論：①M(fèi)EAN顯著抑制HCV復(fù)制。②MEAN通過抑制PTB胞