以洛伐他汀為典型藥物研究巴馬香豬和人代謝的異同.pdf

1、小型豬的心臟與循環(huán)系統(tǒng)與人類相似，易患心血管疾病，因此在作為人類心血管系統(tǒng)動(dòng)物模型方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用小型豬復(fù)制的人類心血管系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型與人類疾病高度相似，利用其研究心血管藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，可以很好指導(dǎo)藥物的臨床應(yīng)用。此外，小型豬是CYP3A4代謝藥物無(wú)需誘導(dǎo)的良好動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)小型豬肝微粒體中存在與人CYP3A家族相似的酶，序列分析顯示小型豬CYP3A與人的CYP3A4有60％的序列同源性，說(shuō)明小型豬作為藥物研究，尤其是人CYP

2、3A4代謝的心血管藥物安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有良好前景。但迄今為止，還沒(méi)有比較系統(tǒng)的研究資料。 我國(guó)具有豐富的小型豬資源，其中巴馬香豬近交程度高、被毛呈白色、耐近交、遺傳穩(wěn)定、個(gè)體表型一致，并積累了豐富的解剖、生理生化及基礎(chǔ)生物學(xué)特性背景資料。但國(guó)內(nèi)小型豬很少應(yīng)用于藥物評(píng)價(jià)研究，其原因在于我國(guó)的基礎(chǔ)研究薄弱，進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)方面的應(yīng)用基礎(chǔ)研究缺乏，尤其受到藥物代謝研究資料不足的限制，使我國(guó)豐富的小型豬資源優(yōu)勢(shì)得不到充分發(fā)揮。

3、 因此，我們選用一種臨床上用于治療動(dòng)脈粥樣硬化并可被細(xì)胞色素P4503A4代謝的藥物——洛伐他汀作為典型藥物，以我國(guó)獨(dú)特的小型豬資源——巴馬香豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從常規(guī)的藥物體內(nèi)過(guò)程(分布和排泄)及長(zhǎng)期毒性，微粒體亞細(xì)胞水平(代謝活性的比較和代謝產(chǎn)物的分析)到單一代謝酶(細(xì)胞色素P4503A)逐層深入研究，希望形成一套完整的CYP3A4代謝的心血管藥物的資料，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)小型豬藥物代謝研究不足的空白，積累小型豬作為人CYP3A4代謝的心血管

4、藥物安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)；并與人和其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行比較研究，突出小型豬在人CYP3A4代謝的心血管藥物中的優(yōu)勢(shì)，為巴馬香豬在藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用提供理論支持，以此推進(jìn)小型豬在新藥安全評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。 研究?jī)?nèi)容和結(jié)果： 逐層對(duì)洛伐他汀在巴馬香豬體內(nèi)的代謝進(jìn)行研究，并與人和其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道資料進(jìn)行比較，獲得比較全面的巴馬香豬在人CYP3A4代謝的心血管藥物中研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

5、 (1)洛伐他汀在巴馬香豬體內(nèi)的分布排泄研究 以抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物洛伐他汀為模型藥，選擇健康6月齡雄性巴馬香豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)灌胃途徑給藥(45 mg/kg或2.4 mg/kg)，采用RP-HPLC方法測(cè)定各組織及體液中的藥物濃度，并對(duì)其組織分布和排泄過(guò)程進(jìn)行研究；通過(guò)透析法測(cè)定血漿蛋白結(jié)合率；對(duì)LV和HA在血漿中轉(zhuǎn)化率進(jìn)行測(cè)定；所有結(jié)果與不同種屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行比較分析。 給藥后，洛伐他汀快速分布到賁門、胃、小腸、肝、大腸、

6、胰、前列腺、肺、腎、心、肌肉、睪丸、腎上腺、膀胱、腦和脾。以胃、腸、肝組織中藥物濃度較高，說(shuō)明藥物在小型豬體內(nèi)具有明顯的胃吸收和肝臟大量攝取的過(guò)程；藥物在小型豬體內(nèi)能通過(guò)大腦屏障；低劑量下的重復(fù)給藥沒(méi)有在小型豬體內(nèi)形成蓄積；96 h尿中累積排泄量為給藥量的7.4％，原形藥經(jīng)膽汁及糞排泄量達(dá)到80％以上；小型豬和人血漿的LV與HA轉(zhuǎn)化極其相似，血漿蛋白結(jié)合率為95％以上。 (2)洛伐他汀在巴馬香豬體內(nèi)的長(zhǎng)期毒性研究 以抗動(dòng)

7、脈粥樣硬化藥物洛伐他汀為模型藥，選擇健康6月齡雄性巴馬香豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)灌胃途徑給藥(12 mg.kg-l和135 mg.kg-1)，對(duì)巴馬香豬進(jìn)行為期6周的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)，觀察給藥后的臨床表現(xiàn)、血液學(xué)、血生化、臟器系數(shù)和組織病理學(xué)等指標(biāo)進(jìn)行藥效和毒性的評(píng)價(jià)。 主要毒性反應(yīng)在135 mg.kg-1組，給藥后巴馬香豬出現(xiàn)了豎毛、腹瀉等癥狀，總采食量下降，體重減輕；血液血檢查顯示白細(xì)胞總數(shù)有所增加，紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量和血小板計(jì)數(shù)

8、明顯下降；血液生化檢查顯示ALT、AST、ALP和CK升高2-10倍，肌酐和尿素有所升高；總膽固醇、低密度脂蛋白、總膽固醇/高密度脂蛋白和低密度脂蛋白/高密度脂蛋白的比率明顯降低，血漿甘油三脂適度降低；組織病理學(xué)切片顯示巴馬香豬出現(xiàn)了與人相似的肝腎病理改變。 (3)洛伐他汀在巴馬香豬中的體外代謝和主要代謝產(chǎn)物研究 選擇人體CYP3A4代謝的典型底物硝苯地平為陽(yáng)性對(duì)照，制備巴馬香豬、人和大鼠的肝微粒體，進(jìn)行洛伐他汀在巴馬香

9、豬肝微粒體中的酶動(dòng)力學(xué)研究，并與人體和大鼠肝微粒體比較；配合體內(nèi)外代謝產(chǎn)物研究，以人肝微粒體P450酶3A亞型的選擇性抑制劑酮康唑(KCZ)和三乙酰竹桃霉素(TAO)和誘導(dǎo)劑利福平，對(duì)小型豬CYP3A亞型的探針?lè)磻?yīng)的抑制和誘導(dǎo)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)；利用UV、HPLC和MS的檢測(cè)手段對(duì)洛伐他汀在巴馬香豬體內(nèi)外的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析檢測(cè)；并與人和常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠相應(yīng)結(jié)果進(jìn)行了比較，從巴馬香豬體內(nèi)外代謝水平進(jìn)行綜合評(píng)估。 巴馬香豬肝微粒體代謝

10、洛伐他汀的酶動(dòng)力學(xué)變化與人體更相似；人體CYP3A特異性抑制劑均可以顯著抑制三者的代謝，但是巴馬香豬代謝速率下降程度與人體接近；利福平可以誘導(dǎo)巴馬香豬中類似人體CYP3A4酶的產(chǎn)生，使豬體內(nèi)CYP3A4底物的代謝活性得到增加；巴馬香豬在洛伐他汀體內(nèi)外的代謝產(chǎn)物與人相當(dāng)接近，在體外微粒體中分別生成主要代謝產(chǎn)物6'-β-羥基- LV(遇酸變構(gòu)為3'-羥基-異-A4'，5'- LV)和6'-掛亞甲基LV，在體內(nèi)膽汁中，pH5.0溫和水解下生成

11、其羥酸形式：在巴馬香豬CYP3A底物代謝反應(yīng)活性測(cè)定、選擇性抑制劑和誘導(dǎo)劑抑制誘導(dǎo)反應(yīng)效果、代謝產(chǎn)物的確定三個(gè)層面，與人和其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行比較，綜合評(píng)定使研究結(jié)果得到多重驗(yàn)證。 (4)巴馬香豬中CYP3A29代謝酶的異源表達(dá)和活性鑒定 選擇巴馬香豬體內(nèi)與人體CYP3A4可能具有相同代謝特征的細(xì)胞色素P4503A29，進(jìn)行大腸桿菌的異源表達(dá)，通過(guò)電泳、免疫印記及相關(guān)的活性測(cè)定，進(jìn)一步提供巴馬香豬類似代謝酶的代謝特點(diǎn)和與人C

12、YP3A4相似的理論資料，比較人體CYP3A4和巴馬香豬細(xì)胞色素P4503A29的活性和相關(guān)代謝反應(yīng)。 通過(guò)去除N端疏水膜定位信號(hào)序列設(shè)計(jì)引物，分別利用pGEM-T載體、pET28b表達(dá)載體和DH5a、DE3菌株對(duì)CYP3A29基因進(jìn)行擴(kuò)增、克隆及表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE和Westem blot驗(yàn)證，獲得CYP3A29的大腸桿菌重組子；優(yōu)化了蛋白表達(dá)條件，在除N端疏水序列/TB/10μM IPTG/25℃的條件下，獲得的可溶性

13、蛋白最多，活性最高；重組子具有人CYP3A4硝苯地平活性，與亞細(xì)胞微粒體水平的體外代謝模型結(jié)果相互驗(yàn)證。 結(jié)論： 1.巴馬香豬是較理想的用于洛伐他汀類心血管藥物藥代動(dòng)力學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。洛伐他汀在巴馬香豬體內(nèi)的過(guò)程與人類似。 2.巴馬香豬可以用作洛伐他汀類心血管藥物毒性研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。洛伐他汀給藥后，巴馬香豬能敏感的反映洛伐他汀的大部分潛在毒性。 3.巴馬香豬肝微粒體適用于作為研究人CYP3A4藥物代謝途

14、徑和特征的體外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在巴馬香豬CYP3A底物代謝反應(yīng)活性測(cè)定、選擇性抑制劑和誘導(dǎo)劑的作用效果、代謝產(chǎn)物的確定三個(gè)層面，與人基本一致。 4.巴馬香豬適用于作為人CYP3A酶代謝的相關(guān)藥物研究的良好動(dòng)物模型：通過(guò)大腸桿菌異源表達(dá)出巴馬香豬CYP3A29蛋白，并具有人CYP3A4硝苯地平活性。 本論文的完成將形成了以洛伐他汀作為典型藥物，以巴馬香豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一套完整藥物代謝數(shù)據(jù)；形成巴馬香豬與人及其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較的