纖維連接蛋白及重組FN肝素結(jié)合域多肽對血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠治療作用的初步研究.pdf

1、纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成份，為一種具有多種功能的糖蛋白大分子，能與肝素、膠原、纖維蛋白以及整合素受體結(jié)合，參與細(xì)胞的粘附、遷移、止血、損傷修復(fù)等過程、在抗感染、維持微血管的完整性等方面具有重要作用。大量研究表明血漿FN水平的測定對感染的預(yù)后評價具有重要意義。嚴(yán)重感染，如敗血癥患者血漿FN水平明顯且急劇降低，給其補(bǔ)充富含F(xiàn)N的冷沉淀素，則在患者血漿FN恢復(fù)的同時，伴有心肺功能的改善及內(nèi)毒素血癥的控制

2、，死亡率也隨之下降。我們前期工作表明FN能降低半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠的死亡率，有助于改善內(nèi)毒素血癥的病情及預(yù)后。重組FN肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29)位于FN的N端，由五個工型的同源結(jié)構(gòu)組成，該結(jié)構(gòu)域的分子量為29kDa，由237個氨基酸組成，可與肝素結(jié)合。應(yīng)用FN肝素結(jié)合域多肽治療鼠內(nèi)毒素血癥和血小板減少模型，目前國內(nèi)外尚未見報道。在本研究中，為了更真實地反映血液病患者常見的感染和出血并存的情況，我們設(shè)計了血小板減少內(nèi)毒素血癥小

3、鼠模型，觀察FN及rhFNHN-29對其療效作用，并初步探討其作用機(jī)制，為FN及rhFNHN-29的臨床應(yīng)用提供理論及實驗依據(jù)。 本文的研究內(nèi)容主要包括： 1．血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型的構(gòu)建 每只小鼠腹腔注射血小板抗血清(APS)lOOgl,30分鐘后腹腔注射500gl含內(nèi)毒素脂多糖(LPS)300gg加半乳糖胺(GaIN)10mg的混合液。通過血小板監(jiān)測和72小時后小鼠的肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察驗證模型是否成

4、功構(gòu)建。 2．FN及rhFNHN-29對血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的作用，并初步探討其作用機(jī)制 (1)采用明膠親和層析法從正常人血漿純化FN，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及WesternBlot鑒定其純度和特異性后，用ELISA法測定其含量；rhFNHN．29多肽從本所自行構(gòu)建的重組FNN端肝素結(jié)合域多肽酵母表達(dá)載體中表達(dá)及制備。 (2)建立血小板減少內(nèi)毒素血癥模型小鼠(BABL／C)共90只，雌雄各半，隨機(jī)分三組

5、，每組30只。FN治療組、rhFNHN-29治療組及生理鹽水對照組分別于注射APS前半小時，注射LPS和GaIN后1個小時，2個小時，3個小時，自尾靜脈注射FN或rhFNHN-29各10mg／kg或等體積的生理鹽水。另外設(shè)兩個對照組，每組20只，分別腹腔注射APS100pl或腹腔注射500gl含LPS300pg加GaIN10mg的混合液。注射APS6小時后，從每組中取lO只小鼠，眶靜脈采血700μl，取50gl(EDTA抗凝)測血象,6

6、50μtl用l／10體積3．8％的枸櫞酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，．20。C冷凍，備測凝血象及TNF-α水平。各組剩余小鼠觀察72小時死亡率。 (3)應(yīng)用病理組織學(xué)、電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的方法檢測FN及rhFNHN-29多肽對血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠組織臟器的影響； (4)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測FN及rhFNHN-29多肽對血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠肝組織細(xì)胞因子TNF．d、IL-6、IL．1βmRNA表達(dá)的影響； (5

7、)應(yīng)用ELISA法檢測FN及rhFNHN-29多肽處理的血小板減少內(nèi)毒素小鼠血漿TNF．α含量的改變： (6)應(yīng)用血細(xì)胞計數(shù)儀及半自動血凝儀檢測FN及rhFNHN-29多肽對血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠血象和凝血象的影響。 取得了以下主要結(jié)果： 1．成功建立了血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型 造模后小鼠血小板經(jīng)監(jiān)測證明始終處于血小板減少的狀態(tài)，較半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠的血小板減少降低約10倍，造模后死亡小鼠的解剖

8、也可發(fā)現(xiàn)腹腔出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血等表現(xiàn)。造模小鼠的肝細(xì)胞病理檢查可見變性壞死，與文獻(xiàn)報道用半乳糖胺敏化內(nèi)毒素小鼠選擇性發(fā)展為肝功能衰竭相一致。因此血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠模型的建立達(dá)到了感染和血小板減少出血并存的要求。 2．FN及rhFNHN-29多肽對血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠具有保護(hù)作用 (1)FN能明顯降低血小板減少內(nèi)毒素血癥小鼠的死亡率。生理鹽水對照組小鼠的72小時死亡率達(dá)90％，F(xiàn)N治療組和rhFNHN-29多肽

9、治療組小鼠72小時死亡率分別為20％和25％。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對照組小鼠肝、腦、肺可出現(xiàn)廣泛的變性、壞死、出血，而FN治療組和rhFNHN-29多肽治療組則僅見局灶性的變性，輕微壞死。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)生理鹽水對照組小鼠肝細(xì)胞呈典型性壞死改變，而FN治療組和rhFNHN-29多肽治療組肝細(xì)胞大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)大致正常。 (2)RT-PCR檢測表明生理鹽水對照組小鼠肝組織TNF．α、IL-6、IL．1βmRNA表達(dá)水平高于正常小

10、鼠，F(xiàn)N治療組及rhFNHN-29多肽治療組小鼠肝組織TNF．α、IL-6、IL-1βmRNA表達(dá)水平則較對照組有明顯下降。 (3)ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)生理鹽水對照組小鼠血漿TNF．d表達(dá)水平顯著增高，F(xiàn)N治療組和rhFNHN-29多肽治療組小鼠血漿表達(dá)水平明顯低于對照組。 (4)血象和凝血象檢測表明FN及rhFNHN-29多肽治療組的血象、凝血象較生理鹽水對照組有明顯改善。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了血小板減少內(nèi)毒