LTB4-BLT2通路對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景：
　　白三烯(leukotriene,LT)作為體內(nèi)重要的炎性介質(zhì),早已被證實(shí)參與機(jī)體多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程。對(duì)白三烯的研究,早期集中于哮喘等呼吸系統(tǒng)慢性炎癥性疾病。后來的研究證實(shí),其他組織或器官的免疫疾病中也已證實(shí),白三烯類脂類介質(zhì)與其他組織或器官的免疫疾病關(guān)系密切,如變異性鼻炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腎小球腎炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。因此,靶向白三烯類及其受體通路的新藥研發(fā)為上述疾病的防治提供新方向。
　　白三烯來

2、源于體內(nèi)細(xì)胞膜磷脂成分的代謝過程。白三烯B4(Leukotriene B4,LTB4),化學(xué)名為5(S),12(R)-二羥基-6(E),8(E),10(E),14(E)-四烯二十烷酸,是強(qiáng)的脂類致炎因子和趨化因子,對(duì)多種細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等均有強(qiáng)烈的趨化和致炎作用。多項(xiàng)研究證實(shí)了LTB4參與體內(nèi)炎癥有關(guān)疾病的進(jìn)程。目前,LTB4受體已有兩種亞型先后被發(fā)現(xiàn),它們同屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein couple

3、d receptor),分別命名為BLT1與BLT2[1-2]。它們各自不同的分布表達(dá)特點(diǎn)提示,二者可能介導(dǎo)不同的功能。BLT1發(fā)現(xiàn)較早,多種與免疫有關(guān)疾病如川崎病、慢性阻塞性肺病、哮喘等與LTB4-BLT1通路的作用機(jī)制關(guān)系研究均較為深入,而對(duì)另一受體——BLT2的研究則相對(duì)緩慢。
　　作為機(jī)體免疫系統(tǒng)最主要的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC),樹突狀細(xì)胞(dendritic cells

4、,DCs)一直是免疫及有關(guān)疾病的研究熱點(diǎn)。DCs的主要功能包括:①攝取、加工和呈遞抗原;②選擇性趨化;③激活初始T細(xì)胞(naiveTcells)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),在膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、關(guān)節(jié)炎、過敏性鼻炎等炎癥有關(guān)的疾病的病理分析中,均存在明顯的DCs浸潤(rùn)[5-8]。正常組織中DCs含量極少,大約占所有免疫細(xì)胞的0.5％-1%。研究表明,DCs表達(dá)BLT2且表達(dá)量伴隨著細(xì)胞成熟過程而上調(diào)[9],提示LTB4-BLT2通路可能與DCs

5、的免疫作用機(jī)制相關(guān)。為進(jìn)一步探究二者的關(guān)系,本課題利用原代培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)制備足量DCs,通過RNA干擾阻斷DCs中BLT2的表達(dá),分析其趨化功能與細(xì)胞因子分泌及表達(dá)功能的改變情況,初步揭示了二者之間互相作用的機(jī)制。為接下來進(jìn)一步探究其二者在免疫性疾病中發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.DCs的誘導(dǎo)制備及檢定:分離原代并培養(yǎng)小鼠骨髓來源單個(gè)核細(xì)胞,利用小鼠重組粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Macroph

6、age Colony Stimulating Factor,GM-CSF)及白細(xì)胞介素4(Interleukin 4,IL-4)誘導(dǎo)分化;細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激為成熟DCs。通過形態(tài)學(xué)觀察初步判定細(xì)胞狀態(tài)與數(shù)量,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面因子CD11c、CD86、MHC-Ⅱ的表達(dá)情況,以檢定DCs。
　　2.通過RT-PCR方法確認(rèn)小鼠DCsBLT2的表達(dá)。
　　3.利用RNA干擾技

7、術(shù)阻斷LTB4-BLT2通路。確定轉(zhuǎn)染效率后,利用不同濃度外源性LTB4刺激阻斷通路的細(xì)胞,利用Transwell趨化小室結(jié)合MTT法共同評(píng)價(jià)DCs趨化功能。
　　4.RT-PCR檢測(cè)小鼠DCs中TNF-α、IL-1β的表達(dá)。
　　5.LTB4刺激包括BLT2阻斷或不阻斷條件下的上述DCs,通過酶聯(lián)免疫法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β的量。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過7天的誘導(dǎo)培養(yǎng),小鼠骨髓細(xì)胞分離出的P

8、BMC獲得1×106個(gè)左右的DCs。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞出現(xiàn)明顯的毛刺狀突起,小部分聚團(tuán)的現(xiàn)象。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,成熟的DCs表面高表達(dá)CD11c、CD86、MHC-Ⅱ細(xì)胞因子,未成熟細(xì)胞表達(dá)量稍低。
　　2.小鼠DCs高表達(dá)BLT2,優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染條件,在基因水平與蛋白水平均可明顯抑制BLT2的表達(dá),從而阻斷LTB4-BLT2通路。
　　3.趨化功能檢測(cè)顯示,LTB4能明顯增強(qiáng)正常DCs的趨化能力,siRNA阻斷

9、BLT2基因表達(dá)的DCs,這種趨化能力明顯被抑制。Transwell結(jié)合MTT數(shù)據(jù)證實(shí),三種濃度LTB4均能明顯增強(qiáng)對(duì)照轉(zhuǎn)染組DCs趨化作用。與空白組相比,低、中、高三組增長(zhǎng)率依次為27.8%、48.4%、71.5%。siRNA阻斷BLT2通路后,LTB4對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞趨化作用明顯被抑制,阻斷組與陰性對(duì)照相比,低、中、高和空白四組抑制率分別為59.5%、58.8%、66%、41.2%。
　　4.DCs表達(dá)TNF-α與IL-1β。以si

10、RNA阻斷BLT2通路表達(dá),可明顯下調(diào)二者mRNA表達(dá)水平。
　　5.ELISA結(jié)果證實(shí),LTB4可刺激正常DCs分泌TNF-α和IL-1β,且分泌量與LTB4濃度成正比。siRNA抑制BLT2表達(dá),可明顯抑制LTB4對(duì)DCs兩種細(xì)胞因子的刺激作用。
　　結(jié)論：
　　1)小鼠成熟DCs表達(dá)BLT2。2)LTB4明顯刺激DCs表達(dá)并分泌TNF-α和IL-1β,siRNA阻斷BLT2的表達(dá)則抑制LTB4的上述作用。3)同樣