JAKs-STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎小球硬化中的作用及苦參堿對(duì)其影響的研究.pdf

1、以TGF-β、CTGF為代表的細(xì)胞因子在腎小球硬化過(guò)程中起重要作用，拮抗細(xì)胞因子的不良作用已成為防治腎小球硬化、延緩腎小球疾病進(jìn)展中的重要環(huán)節(jié)。因此，加強(qiáng)對(duì)腎小球硬化相關(guān)細(xì)胞因子通路的研究是了解腎小球硬化機(jī)制，探索新的治療方法和手段的重要途徑。蛋白酪氨酸激酶(Janus Kinases/Just another Kinases，JAK)/信號(hào)傳導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transducers and activators of t

2、ranscription，STAT)信號(hào)通路是一重要的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)通路。在腎小球硬化過(guò)程中的不同階段，炎癥因子和腎小球硬化相關(guān)細(xì)胞因子的釋放、ECM產(chǎn)生、腎固有細(xì)胞的活化及表型轉(zhuǎn)化可能有不同的JAKs/STATs信號(hào)通路參與，目前尚無(wú)該方面的研究報(bào)道，本研究將探尋JAKs/STATs信號(hào)通路在腎小球硬化的作用，為進(jìn)一步揭示腎小球硬化的生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。 苦參是甘肅省的道地藥材，系藥用豆科槐屬植物苦參(Sophora f

3、lavesceus Air)的干燥根，性寒味苦，具有清熱燥濕，利尿的功效，始載于我國(guó)最早的藥學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》?？鄥A(matrine)和氧化苦參堿(oxymatrine)化學(xué)分子式分別為C15H24N2O和Ci5H24N2O2，分子量分別為266和282，是苦參的主要活性成分，二者在一定條件下可以轉(zhuǎn)化，有多方面的藥理作用和功效，如抗炎、消腫利尿、免疫及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)作用等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿或氧化苦參堿具有抗肝臟纖維化和皮膚纖維的

4、作用。 導(dǎo)師課題組前期研究工作已經(jīng)從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)苦參堿在防治腎臟纖維化有一定作用。但其對(duì)腎小球硬化相關(guān)信號(hào)通路的影響和作用機(jī)制尚不十分清楚，為進(jìn)一步探討苦參堿防治腎臟纖維化的作用機(jī)理，本研究擬通過(guò)在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探尋苦參堿對(duì)JAKs/STATs信號(hào)通路在阿霉素腎小球硬化大鼠中的作用。更加深入的了解苦參堿的作用機(jī)理，為開發(fā)新的防治腎纖維化的臨床藥物提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。 第一部分 JAKs/STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及

5、其內(nèi)源性抑制分子在腎小球硬化大鼠腎組織中的表達(dá) 目的：動(dòng)態(tài)觀察腎小球硬化大鼠模型病理變化過(guò)程中JAKs/STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子和內(nèi)源性抑制分子SOCS、PIAS的表達(dá)，探討腎小球硬化中JAKs/STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子和內(nèi)源性抑制分子SOCS、PIAS的作用和可能機(jī)制，為進(jìn)一步開展防治腎小球硬化研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：60只wistar大鼠隨機(jī)分為兩組：模型組和正常對(duì)照組。模型組采用右側(cè)腎切除加1周后尾靜脈注射阿

6、霉素(5mg/kg)的方法建立腎小球硬化大鼠模型，設(shè)假手術(shù)組為正常對(duì)照組。2、4、6周分批處死每組各10只大鼠，檢測(cè)24小時(shí)蛋白尿、血清肌酐和尿素氮的變化，免疫組化檢測(cè)腎臟COL-IV、α-SMA表達(dá)，以確定成功制備腎小球硬化大鼠模型。采用免疫組化檢測(cè)腎臟STAT1、STAT3的定位表達(dá)，western-blotting檢測(cè)STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3蛋白的定量表達(dá)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)觀

7、察JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PIAS3mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.與對(duì)照組相比，模型組血清肌酐、尿素氮和24小時(shí)蛋白尿從2周起逐漸增高，至第6周明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。組織病理學(xué)染色觀察，模型組大鼠腎組織出現(xiàn)腎小球系膜基質(zhì)中度增多，伴局灶節(jié)段性腎小球硬化，部分腎小球球囊粘連，腎間質(zhì)可見炎性細(xì)胞侵潤(rùn)。腎小球硬化指數(shù)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。模型組COL-I

8、V、α-SMA表達(dá)明顯高于對(duì)照組及試驗(yàn)組(P<0.05)，呈逐漸升高趨勢(shì)：滿腎小球硬化大鼠模型制備成功。 2.Western-boltting結(jié)果顯示，模型組STAT1、P-STAT1蛋白隨著病程的發(fā)展表達(dá)逐漸增高，第4、6周時(shí)同對(duì)照組相比差異有顯著意義。STAT3、P-STAT3蛋白在第2周時(shí)表達(dá)增高，同對(duì)照組相比差異有顯著意義，隨后其表達(dá)逐漸降低。 3.經(jīng)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)果顯示，模型組JAK2mRNA的表達(dá)

9、在第2、4周顯著降低，于第6周增高，且較對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組STAT3mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出在第2周時(shí)顯著增高隨后表達(dá)逐漸降低的趨勢(shì)。模型組JAK1，STAT1，PIAS1mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出先增高后降低，再逐漸增高的趨勢(shì)，且較對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組SOCS1、SOCS3、PIAS3mRNA的表達(dá)在疾病過(guò)程中始終低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子家族

10、在大鼠腎小球硬化模型中的表達(dá)是不同的。不同的信號(hào)分子在腎小球硬化的早、中、晚期表達(dá)趨勢(shì)并不相同，說(shuō)明在腎小球硬化過(guò)程中激活該通路的細(xì)胞因子以及調(diào)節(jié)因素不同，各自對(duì)腎小球硬化的病理過(guò)程的形成起重要作用。 2.內(nèi)源性抑制分子SOCS和PIAS家族在腎小球硬化過(guò)程中也有重要的作用，它們?cè)诓煌牟±黼A段表達(dá)不同，調(diào)節(jié)STAT分子的活化，它們的表達(dá)不足和過(guò)表達(dá)可能與腎小球硬化發(fā)展有關(guān)。 第二部分苦參堿對(duì)腎小球硬化大鼠腎組織JAKs

11、/STATs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子及其內(nèi)源性抑制分子影響的研究 目的：觀察苦參堿對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎小球硬化大鼠JAKs/STATs分子變化的影響，探討苦參堿防治腎小球硬化的機(jī)制。 方法：雄性SPF級(jí)Wistar大鼠90只，體重180-200g，隨機(jī)分成3組：對(duì)照組(假手術(shù)組)30只、模型組30只，苦參堿治療組(苦參堿注射液肌肉注射25mg/kg.d)30只。檢測(cè)各組術(shù)后第6周的尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及腎組織病理改變，并應(yīng)用免疫

12、組織化學(xué)方法檢測(cè)COL-IV、α-SMA、STAT1和STAT3蛋白質(zhì)在腎皮質(zhì)組織中的表達(dá)，以確定腎小球硬化模型的成功及苦參堿的防治效果。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)觀察JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3、PIAS1、PIAS3mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.苦參堿治療組的尿蛋白排泄量、血肌酐和尿素氮水平均低于模型組，腎小球硬化程度輕于模型組(P<0.05)，腎皮質(zhì)COL-IV、

13、α-SMA蛋白表達(dá)也低于模型組(P<0.05)。 2.苦參堿治療組的STAT1蛋白水平于2周末高于模型組，在6周低于模型組(P<0.05)，STAT3蛋白表達(dá)在個(gè)時(shí)間段均低于模型組(P<0.05)。 3.經(jīng)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果顯示，和模型組相比苦參堿治療組JAK2、STAT1、STAT3、PIAS1mRNA表達(dá)降低，SOCS1、SOCS3、PIAS3mRNA表達(dá)顯著增高 結(jié)論：苦參堿對(duì)腎小球硬化大鼠模型腎臟病變