苦參堿對大鼠肝癌前病變的阻斷作用及對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計全世界每年新發(fā)病例數(shù)超過50萬，其中我國占20％，其死亡率在我國惡性腫瘤中居第二位。HCC的發(fā)生是多基因突變、多因素、多途徑的過程。其中信號傳導(dǎo)在腫瘤形成過程中的作用正在逐步被闡明，信號傳導(dǎo)通路已成為抗腫瘤藥物研究的新靶點(diǎn)。近年來,肝癌前病變期的特殊病理改變逐漸引起了國內(nèi)外學(xué)者的注意，發(fā)現(xiàn)此階段雖然細(xì)胞形態(tài)尚未發(fā)生明顯改變，但已出現(xiàn)一些酶學(xué)及蛋白表達(dá)異常，這些細(xì)胞在某些

2、因素持續(xù)作用下可發(fā)生癌變，故深入研究此階段的病理機(jī)制，為早期干預(yù)逆轉(zhuǎn)這種初始病變、阻斷肝癌形成提供了理論依據(jù)。本研究應(yīng)用酶組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)等技術(shù)研究了大鼠肝癌前病變的病理改變及Wnt信號通路的變化，同時應(yīng)用血清藥理學(xué)方法，探討了苦參堿誘導(dǎo)大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F 344細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞定向分化的作用，推測此作用可能是通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路實現(xiàn)的。 第一部分苦參堿對大鼠肝癌前病變的阻斷作用及對Wnt信號通路的影響

3、 目的：觀察大鼠肝癌前病變的形態(tài)學(xué)、酶學(xué)、蛋白表達(dá)的改變，了解肝癌前病變期的基本病理改變以及苦參堿阻斷肝癌前病變過程中Wnt信號通路的作用。 方法： 1.肝癌前病變模型的建立：60只大鼠隨機(jī)分為3組：A：模型組；B：苦參堿組；C：正常對照組。A、B組采用腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)+含0.015％二乙酰氨基芴(2-AAF)飼料飼養(yǎng)+2/3肝切除方法復(fù)制大鼠肝癌前病變模型，B組給予苦參堿灌胃，7周末實驗結(jié)束。

4、 2.應(yīng)用蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各實驗組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變；酶組織化學(xué)觀察各組肝組織γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GTase)、三磷酸腺苷酶(ATPase)分布及定量比較；免疫組織化學(xué)觀察各組Thy-1(CD90)、白蛋白(ALB)、甲胎球蛋白(AFP)、Wnt-1蛋白，軸蛋白(Axin)，β鏈蛋白(β-catenin)分布及定量比較。 結(jié)果： 1.肝臟癌前病變模型組織HE染色：7周末A組模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)消失，匯

5、管區(qū)小膽管增生，沿小膽管外側(cè)可見卵圓細(xì)胞大量增生，有的卵圓細(xì)胞以匯管區(qū)為中心向肝實質(zhì)內(nèi)爬伸樣生長，破壞鄰近肝板；B組肝小葉結(jié)構(gòu)存在，可見少量變異肝細(xì)胞，卵圓細(xì)胞增生較少。 2.酶組化染色：γ-GTase:A組可見多處位于匯管區(qū)周圍或肝小葉內(nèi)鮮艷的橢圓形玫瑰紅色陽性反應(yīng)灶。B組病灶著色明顯較淡，病灶范圍小，A、B組單位面積內(nèi)病灶面積為(mm2/cm2)：8.24±0.53、3.25±0.47，B組有顯著抑制γ-GT酶變灶的作用(P

6、<0.01)。ATPase：A組均可見到位于肝小葉內(nèi)的橢圓形陰性反應(yīng)灶，B組病灶范圍均縮小。 3.免疫組化染色：C組中Thy-1、AFP蛋白表達(dá)陰性，A組AFP蛋白在匯管區(qū)或肝小葉內(nèi)高表達(dá)，B組表達(dá)下調(diào)；ALB在C組肝組織中彌漫性均勻表達(dá)，在A組中表達(dá)明顯減少，B組表達(dá)上調(diào)，B組、C組與A組比較有顯著差異。Wnt-1、β-catenin在C組中肝組織細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)均勻一致少量表達(dá)，A組可見匯管區(qū)周邊及肝小葉內(nèi)增生灶中強(qiáng)陽性表達(dá)，

7、經(jīng)B組苦參堿干預(yù)后陽性區(qū)域的面積及著色深度均有不同程度減少；Axin在C組中肝細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)呈陽性表達(dá)，部分細(xì)胞核表達(dá)，A組表達(dá)減弱，病灶區(qū)表達(dá)陰性，B組苦參堿干預(yù)后陽性區(qū)域的面積及著色深度均有不同程度增高；B組、C組與A組比較有顯著差異。 結(jié)論： 1.大鼠肝癌前病變階段以卵圓細(xì)胞大量增生為特征性改變，病灶內(nèi)γ-GTase、ATPase、Thy-1、AFP表達(dá)較強(qiáng)，苦參堿可減輕上述病變，誘導(dǎo)ALB表達(dá)。 2.苦參

8、堿具有誘導(dǎo)肝癌前病變中卵圓細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞發(fā)育分化的作用，而此作用與下調(diào)Wnt信號通路的活性有關(guān)。 第二部分　苦參堿對大鼠肝卵賀細(xì)胞WB－F344細(xì)胞增殖及對Wnt信號通路的調(diào)控作用 目的：了解體外培養(yǎng)的大鼠肝卵圓細(xì)胞株WB-F 344細(xì)胞中Wnt信號的表達(dá)情況及苦參堿對WB-F 344細(xì)胞表達(dá)Wnt信號分子的調(diào)節(jié)作用，探討苦參堿對該細(xì)胞分化的影響。 方法： 1.肝卵圓細(xì)胞的培養(yǎng)與藥物干預(yù)：無菌培養(yǎng)WB-

9、F 344細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測苦參堿對WB-F 344細(xì)胞株增殖影響，并應(yīng)用經(jīng)典誘導(dǎo)劑丁酸鈉作為對照。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測苦參堿、丁酸鈉對WB-F 344細(xì)胞表達(dá)AFP、ALB、Wnt-1、Axin、β-catenin的影響。 結(jié)果： 1.苦參堿和丁酸鈉處理后卵圓細(xì)胞變大，核漿比減小，雙核細(xì)胞增多，隨著用藥濃度和時間的增加，變化越明顯。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果：空白對照組：AFP、Wnt-1、A

10、xin、β-catenin表達(dá)陽性，ALB表達(dá)陰性；苦參堿組和丁酸鈉組：AFP、Wnt-1、β-catenin表達(dá)明顯減弱，Axin表達(dá)增強(qiáng)，并且出現(xiàn)ALB的陽性表達(dá)。苦參堿組和丁酸鈉組與空白對照組比較有顯著性差異，苦參堿組和丁酸鈉組之間比較無顯著差別。 結(jié)論： 1.苦參堿可抑制WB-F 344細(xì)胞增殖，且此抑制作用存在時間、劑量依賴性。 2.苦參堿可誘導(dǎo)細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞方向分化，此分化過程與下調(diào)Wnt信號通路的