清肝化瘀方藥對(duì)大鼠肝癌前病變的阻斷作用及對(duì)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，在我國(guó)每年約有10萬(wàn)人新患此病，其死亡率在我國(guó)惡性腫瘤中居第二位。目前手術(shù)切除仍是治療肝癌的首選方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，遠(yuǎn)期療效不明確，治療頗為棘手。近年來(lái)，隨著綜合治療概念的確立，中醫(yī)藥積極參與肝癌的臨床防治，有計(jì)劃地與手術(shù)治療、放療、化療相結(jié)合，可明顯減少不良反應(yīng)，使肝癌總體療效得到了進(jìn)一步提高。清肝化瘀方藥為姚樹(shù)坤教授根據(jù)祖國(guó)

2、傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論和多年臨床經(jīng)驗(yàn)研制的治療肝癌的經(jīng)驗(yàn)方，該方以解毒利濕、破瘀散結(jié)、健脾行氣為法則，以往臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)對(duì)肝硬化、肝癌有明顯的阻斷作用，可從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)抑制腫瘤形成和進(jìn)展。 目前公認(rèn)的腫瘤發(fā)生模式是多基因突變、多因素、多途徑、多步驟的過(guò)程，在此過(guò)程中一些重要的生長(zhǎng)因子及其受體通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制著細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、凋亡等所有活動(dòng)。細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常，會(huì)導(dǎo)致腫瘤快速增殖、無(wú)限生長(zhǎng)。隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的發(fā)展

3、，信號(hào)傳導(dǎo)在腫瘤形成過(guò)程中的作用正在逐步被闡明，信號(hào)傳導(dǎo)通路已成為抗腫瘤藥物研究的新靶點(diǎn)。最新研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路在許多腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但關(guān)于其對(duì)肝癌及肝癌前病變期作用的報(bào)道尚不多見(jiàn)。近年來(lái)，肝癌前病變期的特殊病理改變逐漸引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的注意，發(fā)現(xiàn)此階段雖然細(xì)胞形態(tài)尚未發(fā)生明顯改變，但已出現(xiàn)一些酶學(xué)及蛋白表達(dá)異常，這些細(xì)胞在某些因素持續(xù)作用下可發(fā)生癌變，故深入研究此階段的病理機(jī)制，為早期干預(yù)逆轉(zhuǎn)這種初始病變、阻斷肝

4、癌形成提供了理論依據(jù)。 為此，本研究應(yīng)用酶組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR等技術(shù)研究了肝癌前病變的一些基本病理改變及Notch信號(hào)通路的變化，觀察了清肝化瘀方藥對(duì)肝癌前病變的阻斷作用及對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)應(yīng)用血清藥理學(xué)方法，探討了清肝化瘀方含藥血清誘導(dǎo)大鼠肝卵圓細(xì)胞WB-F344 細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞定向分化的作用，推測(cè)此作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。 第一部分清肝化瘀方藥對(duì)大

5、鼠肝癌前病變的阻斷作用 目的：觀察大鼠肝癌前病變的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、酶學(xué)、蛋白表達(dá)的改變，了解肝癌前病變期的基本病理改變以及清肝化瘀方藥對(duì)肝癌前病變的阻斷作用。 方法 1．90只大鼠隨機(jī)分為4組：A：模型組；B：清肝化瘀方藥等效劑量組；C：清肝化瘀方藥大劑量組；D：苦參堿組；E組：正常對(duì)照組。A、B、C、D組采用腹腔注射二乙基亞硝胺(Diethvlnitrosamine，DEN)+2/3肝切除方法復(fù)制大鼠肝癌

6、前病變模型，B、C、D組同時(shí)分別給予不同劑量清肝化瘀方藥和苦參堿灌胃，7周末實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 2．應(yīng)用蘇木素-伊紅(Hematoxin eosin，HE)染色觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)改變；透射電鏡觀察病變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；酶組織化學(xué)觀察各組肝組織γ- 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(Glutamyl-transpeptidase，γ-GTase)、三磷酸腺苷酶(Adenosine triphosphatase，ATPase)、葡萄糖-6-磷酸酶(G

7、lcose-6-phosphatase，G-6-Pase)分布及定量比較；免疫組織化學(xué)觀察各組Thy-1(CD90)、白蛋白(Albumin，ALB)、甲胎球蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)分布及定量比較。 結(jié)果 1．HE染色：7周末模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)消失，匯管區(qū)小膽管增生，沿小膽管外側(cè)可見(jiàn)卵圓細(xì)胞大量增生，有的卵圓細(xì)胞以匯管區(qū)為中心向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)爬伸樣生長(zhǎng)，破壞鄰近肝板；B、C、D組肝小葉結(jié)構(gòu)存在，可見(jiàn)

8、少量變異肝細(xì)胞，卵圓細(xì)胞增生較少，C組病理改變最輕。 2．透射電鏡：卵圓細(xì)胞可分為三型，從Ⅰ型到Ⅲ型細(xì)胞體積逐漸增大，胞內(nèi)細(xì)胞器逐漸豐富，細(xì)胞內(nèi)的張力微絲及細(xì)胞間的橋粒聯(lián)接為卵圓細(xì)胞的特征性結(jié)構(gòu)。 3．酶組化染色：γ-GTase：A組可見(jiàn)多處位于匯管區(qū)周圍或肝小葉內(nèi)鮮艷的橢圓形玫瑰紅色陽(yáng)性反應(yīng)灶。B、C、D組病灶著色明顯較淡，病灶范圍小，A、B、C、D組單位面積內(nèi)病灶面積為(mm<'2>/cm<'2>，單位下略)：8.2

9、4±0.53、4.39±0.48、3.16±0.53、3.25±0.47，B、C、D組有明顯抑制γ-GT酶變?cè)畹淖饔?P<0.05或P<0.01)，C、D組較B組作用更明顯(P<0.01)，C、D組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。ATPase、G-6-Pase：A組均可見(jiàn)到位于肝小葉內(nèi)的橢圓形陰性反應(yīng)灶，B、C、D組病灶范圍均縮小。 4.免疫組化染色：E組中Thy-1、AFP蛋白表達(dá)陰性，A組Thy-1、AFP蛋白在匯管區(qū)或肝小

10、葉內(nèi)高表達(dá)，B、C、D組表達(dá)下調(diào)；ALB在E組肝組織中均勻彌漫陽(yáng)性表達(dá)，在A組中表達(dá)明顯減少，B、C、D組表達(dá)上調(diào)，A-E組光密度值分別為：Thy-1：150.49±9.45、135.16±6.15、103.83±3.72、102.70±7.75、79.19±6.32：AFP：130.34±10.50、113.38±8.20、89.29±7.05、84.94±5.08、62.82±7.00：ALB：108.79±9.31、130.50±

11、12136、157.47±6.81、159.86±9.74、186.84±9.75。B、C、D組與A組比較有明顯差異(P<0.05或P<0.01)，C、D組較B組作用更明顯(P<0.01)，C、D組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論 1.大鼠肝癌前病變階段具有典型的病理改變特點(diǎn)，卵圓細(xì)胞大量增生為特征性改變，清肝化瘀方藥和苦參堿可減輕上述病變。 2．根據(jù)酶組化染色結(jié)果推測(cè)肝癌前病變機(jī)理為細(xì)胞氨基酸分子轉(zhuǎn)運(yùn)及合

12、成過(guò)度活躍、Ca<'2+>內(nèi)流、糖代謝紊亂等，而清肝化瘀方藥及苦參堿可能是通過(guò)抑制病變細(xì)胞氨基酸的過(guò)度轉(zhuǎn)運(yùn)合成、抑制Ca<'2+>內(nèi)流、穩(wěn)定糖代謝等機(jī)制起到阻斷癌前病變作用的。 3．根據(jù)免疫組化染色結(jié)果推測(cè)在肝癌前病變期出現(xiàn)大量具有原始干細(xì)胞特性的細(xì)胞，這些細(xì)胞表達(dá)某些肝癌細(xì)胞的特征，清肝化瘀方藥和苦參堿可能具有誘導(dǎo)某些原始干細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞發(fā)育分化的作用。 第二部分清肝化瘀方藥對(duì)肝癌前病變大鼠 Notch信號(hào)通路的影響

13、 目的：了解大鼠肝癌前病變期Notch信號(hào)分子的蛋白、基因表達(dá)情況以及清肝化瘀方藥對(duì)Notch信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用，探討Notch信號(hào)通路對(duì)肝癌前病變的作用以及清肝化瘀方藥阻斷肝癌前病變的分子機(jī)制。 方法 1．實(shí)驗(yàn)分組同第一部分，免疫組化方法觀察各實(shí)驗(yàn)組肝組織Notchl受體Jaggedl配體蛋白定位、定量表達(dá)情況。 2．半定量逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription- polym

14、erasechain reaction，RT-PCR)方法觀察各實(shí)驗(yàn)組肝組織AFPmRNA、ALBmRNA、NotchlmRNA、JaggedlmRNA、RBP-J k mRNA、Hes-lmRNA表達(dá)情況。 結(jié)論：在肝癌前病變期Notch信號(hào)通路各分子蛋白及基因均高表達(dá)，經(jīng)清肝化瘀方藥和苦參堿干預(yù)后表達(dá)逐漸減低，提示清肝化瘀方藥和苦參堿可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路起到阻斷肝癌前病變作用。 第三部分清肝化瘀方含藥血清

15、對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞WB- F344 細(xì)胞增殖及Notch信號(hào)通路的調(diào)控作用 目的：了解在體外培養(yǎng)的大鼠肝卵圓細(xì)胞株 WB F-344細(xì)胞上Notch信號(hào)的表達(dá)情況及清肝化瘀方含藥血清對(duì) WB F-344細(xì)胞表達(dá)Notch信號(hào)分子的調(diào)節(jié)作用，探討清肝化瘀方含藥血清對(duì)該細(xì)胞分化發(fā)育的影響。 方法 1.含藥血清的制備及分組：各組動(dòng)物造模及給藥方法同第一部分，7周末給藥后2h麻醉動(dòng)物，下腔靜脈無(wú)菌取血，分離血清，抽濾除菌，

16、-80℃凍存?zhèn)溆谩?A：肝癌前病變模型組血清；B：清肝化瘀方含藥血清；C：苦參堿含藥清；D：正常大鼠血清對(duì)照組。 2.MTT法檢測(cè)清肝化瘀方含藥血清和苦參堿含藥血清對(duì)WB F-344細(xì)胞株增殖影響。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)清肝化瘀方含藥血清和苦參堿含藥血清對(duì)WBF-344 細(xì)胞表達(dá)AFP、ALB、Notchl蛋白的影響。 4.RT-PCR檢測(cè)清肝化瘀方含藥血清和苦參堿含藥血清對(duì)WB F-344 細(xì)胞表達(dá)AFPm

17、RNA、ALBmRNA、NotchlmRNA、HESlmRNA的影響。 結(jié)論 1.清肝化瘀方藥含藥血清和苦參堿含藥血清有抑制WB F-344 細(xì)胞增殖的作用，清肝化瘀方藥含藥血清較苦參堿含藥血清作用更明顯。 2.清肝化瘀方藥含藥血清和苦參堿含藥血清可下調(diào)WB F-344 細(xì)胞Notch信號(hào)分子、AFP的蛋白及基因表達(dá)，誘導(dǎo)ALB蛋白及基因表達(dá)，清肝化瘀方藥含藥血清較苦參堿含藥血清作用更明顯。推測(cè)清肝化瘀方藥含藥血