來氟米特對腎小球硬化中TGF-β-Smad信號通路影響的研究.pdf

1、目的：腎小球硬化是多種腎臟病慢性進展至終末期腎哀竭的共同途徑，因此，探討腎臟纖維化的有效防治有重要意義。轉(zhuǎn)化牛長因子（TGF-β1）在腎小球硬化過程中起重要作用。來氟米特（LEF）是一種免疫抑制劑。本實驗選用不同濃度來氟米特進行干預研究，觀察來氟米特（LEF）對轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）刺激大鼠腎小球系膜細胞表達Ⅳ型（ColⅣ膠原）及Smad2/3表達的影響。探討其對TGF-β1/Smad信號傳導通路的作用，為來氟米特的腎臟保護作

2、用提供理論依據(jù)。 方法：采用體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞的經(jīng)典方法進行系膜細胞（GMC）的復蘇、培養(yǎng)、傳代和鑒定后3～10代用于實驗。 實驗分組： （1）對照組（Ctrl）， （2）刺激組（TGF-β1，5ng/ml）， （3）LEF-1組（5μg/ml）+TGF-β1（5ng/ml）， （4）LEF-2組（50μg/ml）+TGF-β1（5ng/ml）。 分別于不同作用時間點（15

3、min、30min、1h、2h、6h）:①用間接免疫熒光法檢測P-Smad2/3表達的情況；②用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法測定細胞培養(yǎng)上清液的ColⅣ膠原蛋白表達量的變化。③采用熒光半定量RT-PCR法檢測Smad2mRNA表達的變化； 結(jié)果： ①間接免疫熒光結(jié)果 P-Smad2/3在對照組只有微量的表達，在TGF-β1（5ng/ml）刺激后30min細胞熒光著色顯著增強且集中在胞核及周邊。激活至少持續(xù)

4、2h，2h蛋白表達回落，細胞熒光著色轉(zhuǎn)淡并散在細胞質(zhì)中。與TGF-β1刺激組相比加上LEF（5μg/ml）、（50μg/ml）組P-Smad2/3蛋白表達下降，細胞熒光強度隨時間延長及濃度加大而減弱。 ②細胞上清液檢測結(jié)果 在對照組ColⅣ膠原僅有少量基礎性分泌。與對照組相比TGF-β1（5ng/ml）刺激在30min、1h時間點ColⅣ膠原分泌量顯著上升，其刺激作用呈時間依賴關系15min開始上升30min達高峰后Co

5、lⅣ膠原分泌量較前下降。與TGF-β1（5ng/ml）刺激組相比加上LEF（5μg/ml）、（50μg/ml）的抑制組ColⅣ膠原蛋白表達量明顯下降在30min到1h有顯著差異。但兩抑制組在2h及6h時間點ColⅣ膠原蛋白表達量無顯著差異。無統(tǒng)計學意義。隨時間增加抑制率增加說明其抑制作用也呈時間依賴性關系。 ③熒光定量PCR結(jié)果 TGF-β1（5ng/ml）刺激組與對照組比較：Smad2mRNA在大鼠系膜細胞表達水平T

6、GF-β1（5ng/ml）刺激組組顯著高于對照組、加LEF處理（5μg/ml）、（50μg/ml）組的Smad2mRNA表達水平顯著低于TGF-β1（5ng/ml）刺激組組（F=11．836）。 結(jié)論： 1．人重組TGF-β1（5ng/ml）能顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞P-Smads蛋白的表達。 2． TGF-β1/Smad信號傳導途徑在大鼠腎小球系膜細胞的激活能夠引起ColⅣ膠原分泌增多，其作用呈一定