PAX3-FKHR-PAX7-FKHR和miRNA-1在眼眶橫紋肌肉瘤分型及判斷預(yù)后中的作用.pdf

1、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)是兒童期最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占兒童全部惡性腫瘤的5％，占兒童所有軟組織肉瘤的50％。該腫瘤起源于中胚葉未分化的多能間充質(zhì)細(xì)胞，惡性程度高，發(fā)展快，病死率較高，嚴(yán)重威脅患者生命。 眼眶橫紋肌肉瘤占所有橫紋肌肉瘤的12％，占頭頸部橫紋肌肉瘤的25-35％，發(fā)病率在眼眶惡性腫瘤中居第一位。該腫瘤預(yù)后差別大，患者預(yù)后與多種因素有關(guān)。目前在診斷上以常規(guī)病理、免疫組化為主要手段。病理

2、診斷上將該腫瘤分為胚胎型(embryonal rhabdomyosarcoma，ERMS)、腺泡型(alveolar rhabdomyosarc-oma，ARMS)和多形型(pleomorphic rhabdomyosarcoma，PRMS)三個亞型。胚胎型最常見，多形型極少見，此兩型預(yù)后相對。腺泡型較胚胎型少，但是病情兇險，預(yù)后差。由于不同的亞型的預(yù)后和治療方式不同，因此，準(zhǔn)確的診斷和分型至關(guān)重要。但目前常用的常規(guī)病理和免疫組化對部分

3、病例的診斷尤其是分型存在困難，需要探索新的手段，分子生物學(xué)的進(jìn)步為該研究提供了可能。本研究旨在探索融合基因PAX3-FKHR、PAX7-FKHR、微小核糖核酸(miRNA)作為病理診斷補(bǔ)充手段的科學(xué)性及研究其與預(yù)后的關(guān)系。 橫紋肌肉瘤中PAX3-FKHR和PAX7-FKHR產(chǎn)生于染色體t(2；13)、(q35；q14)易位。由生肌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PAX35ˊ端DNA結(jié)合區(qū)與另一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FKHR3ˊ端的反式激活區(qū)連接形成。PAX3

4、-FKHR、PAX7-FKHR參與細(xì)胞多種代謝，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。通過檢測上述融合基因的存在，有助于對該腫瘤進(jìn)行診斷和分型并對預(yù)后進(jìn)行判斷。 miRNA是一種進(jìn)化上十分保守的、非編碼的單鏈小RNA家族，長度為18～25個核苷酸堿基，通過調(diào)節(jié)不同的靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞生理和病理過程中起重要作用。miRNA參與器官產(chǎn)生、組織分化、細(xì)胞增殖、脂類代謝、凋亡和腫瘤的發(fā)生。文獻(xiàn)顯示miRNA還可用于腫瘤的分型。到目前為止，未見橫紋肌

5、肉瘤中miRNA表達(dá)的報道。本研究通過檢測miRNA在眼眶橫紋肌肉瘤中的表達(dá)，探討其在判斷腫瘤預(yù)后中應(yīng)用價值。 本研究對2001年1月到2007年9月在武警總醫(yī)院眼眶病研究所住院手術(shù)的29例眼眶橫紋肌肉瘤患者臨床資料進(jìn)行分析，對所有病例進(jìn)行隨訪。對29例病例的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)HE染色，觀察組織病理學(xué)特征。針對抗原Vimentin、MyoDl、Myoglobin、actin、Desmin、CD99、Ki-67、P53，對所有標(biāo)本進(jìn)

6、行免疫組化染色。 10例眼眶非肌源性小細(xì)胞惡性腫瘤標(biāo)本為病例對照組，5例正常眼眶橫紋肌標(biāo)本為正常對照組(來源于眼外肌手術(shù)切除的眼外肌標(biāo)本)。 從石蠟包埋腫瘤組織中提取的總RNA為模板，β-actin為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行RT-PCR和半巢式PCR檢測PAX3-FKHR和PAX7-FKHR，用DNA測序的方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)。 通過包含1320個探針的芯片用來檢測miRNA在眼眶橫紋肌肉瘤中的表達(dá)，對13例標(biāo)本和5例對照

7、組標(biāo)本進(jìn)行檢測，使用微陣列差異分析軟件進(jìn)行分析，通過Real time PCR的方法對特異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行確認(rèn)。使用SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，生存率比較采用Kaplan-meiler法。 29例標(biāo)本中有19例形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和免疫組化染色結(jié)果比較典型，組織病理上診斷為胚胎型橫紋肌肉瘤；2例有特征性纖維血管隔，并且形成腺泡樣結(jié)構(gòu)，診斷為腺泡型橫紋肌肉瘤；8例病變形態(tài)學(xué)表現(xiàn)不典型，腫瘤細(xì)胞分化較差，主要結(jié)合免疫組化染色診斷為OR

8、MS，但無法分型。 29例標(biāo)本中有27例成功提取出RNA，其中7例檢測到PAX3─FKHR和PAX7-FKHR的表達(dá)，表達(dá)率為26％。病例對照組和正常人對照組均未檢出PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的表達(dá)，實驗組與對照組間差異顯著(P＜0.01)。病理上未分型的8例中5例PAX3-FKHR和PAX7-FKHR的表達(dá)陽性，3例表達(dá)陰性。結(jié)合文獻(xiàn)，5例陽性表達(dá)者歸為腺泡型，3例陰性者歸為胚胎型。 通過芯片的檢測，發(fā)現(xiàn)在

9、腫瘤組織中，hsa-miR-106a、hsa-miR-18b、hsa-miR-92a三種表達(dá)顯著增高，最高的有11.8倍，hsa-miR-29a、hsa-miR-22、hsa-miR-133b、hsa-miR-133a、hsa-miR-29b、hsa-miR-1、hsa-miR-29c七種表達(dá)顯著下降。使用Realtime PCR確認(rèn)hsa-miR-1在腫瘤組織中表達(dá)顯著下降。結(jié)合隨訪資料，表達(dá)下降的程度與病人的預(yù)后相關(guān)，hsa-miR

10、-1下降越多，預(yù)后越差。 本研究認(rèn)為常規(guī)病理和免疫組化對大部分典型病例可明確診斷和分型，但對部分腫瘤細(xì)胞分化差的病例在診斷上特別是病理分型上有其局限性，PAX3-FKHR/PAX7-FKHR、miRNA-1可作為ORMS分型診斷和判斷預(yù)后的有效參考指標(biāo)。另外，與正常眼眶橫紋肌組織比較，首次發(fā)現(xiàn)ORMS中154個miRNA有差異性表達(dá)，其中10個差異性最明顯，對進(jìn)一步研究提供了思路。對其中的hsa-miR-1在ORMS中的表達(dá)量進(jìn)