巰基烷基化殼聚糖介導(dǎo)共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hVEGFl2lcDNA-hBMP4體外轉(zhuǎn)染的研究.pdf

1、目的：以新型巰基烷基化殼聚糖(TACS) 為載體介導(dǎo)重組共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP4 體外轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），探討TACS 用作骨組織工程中基因載體的可行性，為進(jìn)一步研究骨缺損的聯(lián)合基因治療提供實(shí)驗基礎(chǔ)。
　　 方法：全骨髓培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠MSCs；真核共表達(dá)質(zhì)粒pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP4 經(jīng)酶切鑒定后，復(fù)凝聚法制備TACS-基因納米粒，用透射電鏡對其形態(tài)

2、和粒徑進(jìn)行觀察和表征，凝膠阻滯分析其對基因的保護(hù)情況；
　　 將納米粒轉(zhuǎn)染第3 代大鼠MSCs，并設(shè)殼聚糖組、脂質(zhì)體組、及裸質(zhì)粒組分別為實(shí)驗對照、陽性對照及陰性對照，噻唑藍(lán)（MTT）法比較不同基因載體細(xì)胞毒性的差異；分別于轉(zhuǎn)染后3,4d 提取MSCs的總RNA、總蛋白，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、Western blot 檢測目的基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：全骨髓培養(yǎng)法可獲得大量MSCs 并具有活躍增殖能力；

3、共表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，與預(yù)期結(jié)果相符；TACS/pDNA 復(fù)合納米粒形態(tài)不很均一，平均粒徑約264nm；凝膠阻滯分析證明TACS 能有效地包裹和保護(hù)共表達(dá)質(zhì)粒不受DnaseⅠ酶的消化；對轉(zhuǎn)染后各組MSCs 相關(guān)指標(biāo)檢測顯示，TACS 組細(xì)胞存活率(73.18±6.56)％，明顯高于脂質(zhì)體組(45.92±4.93)％(P<0.01)；除陰性對照組外,RT-PCR和Western blot 均檢測到轉(zhuǎn)染后MSCs 中hVEGF121 及hB