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1、背景及目的:殼聚糖是一種廣泛存在于自然界的陽離子多聚糖,易與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合形成復(fù)合體。自從Mumper等首次報(bào)道了以殼聚糖作為基因載體運(yùn)載質(zhì)粒到細(xì)胞內(nèi)后,殼聚糖及其衍生物作為基因載體便成了研究者們的研究熱點(diǎn)。前期試驗(yàn)在殼聚糖鏈上引入部分疏水烷基鏈,形成烷基化殼聚糖,并在此基礎(chǔ)上引入巰基,提高了殼聚糖的轉(zhuǎn)染率及改善其水溶性。這些載體攜載的基因大多數(shù)都是在較短時(shí)間(72h內(nèi))瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。但是,某些情況下希望基因被緩慢釋放,從而達(dá)到基因的
2、長(zhǎng)期表達(dá)。本研究制成以羥丁基殼聚糖(HBC)為殼,以巰基烷基化殼聚糖(TACS)包埋基因質(zhì)粒為核的殼核結(jié)構(gòu),以探討其作為緩釋基因載體的可行性。
方法:TACS與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(pEGFP)以復(fù)凝聚法制成納米微球作為核結(jié)構(gòu)(TACS/pEGFP),然后與溫敏性HBC混合包裹以及冷凍干燥合成羥丁基殼聚糖-巰基烷基化殼聚糖/pEGFP(HBC-TACS/pEGFP)殼核結(jié)構(gòu);利用動(dòng)態(tài)光散射儀器、透射電鏡對(duì)核及核殼結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征
3、。凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)復(fù)合基因納米粒子對(duì)pEGFP的攜載以及保護(hù)作用。熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡對(duì)HEK293T細(xì)胞和小鼠的骨骼肌進(jìn)行體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染,檢測(cè)基因復(fù)合納米粒能否作為緩釋基因載體。
結(jié)果: HBC-TACS/pEGFP納米微球多呈球形,粒徑為(317.6±55.9)nm,表面Zeta電位為(2.3±1.1)mV,可有效保護(hù)pEGFPA免受DNase I的降解。在體外轉(zhuǎn)染經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定,HBC-TACS/pEGFP的基
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