微環(huán)境酸化通過ASICs調(diào)控DC功能.pdf

1、酸堿平衡是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)，正常情況下，外周血和各器官組織的pH約為7.2～7.4。某些病理狀態(tài)（如炎癥、腫瘤和自身免疫?。┫?，病灶部位酸化（pH下降）是參與相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展的重要因素。因此，探討酸化對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)（主要是各類免疫細(xì)胞）功能的影響，具有重要意義。
　　 抗原提呈細(xì)胞（APC）重要的免疫系統(tǒng)組分，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。樹突狀細(xì)胞（DC）是體內(nèi)最重要的的專職APC，負(fù)責(zé)攝取、加工和處

2、理抗原，并將抗原信息提呈給初始T 細(xì)胞，啟動(dòng)抗原特異性T 細(xì)胞應(yīng)答。已證明，DC表面多種膜分子參與抗原提呈過程：DC表面MHC分子與抗原肽結(jié)合為復(fù)合物（pMHC），將抗原肽提呈給T 細(xì)胞（產(chǎn)生第一信號(hào)）；DC表面CD80 或CD86 與T細(xì)胞表面CD28 結(jié)合，可提供T 細(xì)胞激活的第二信號(hào)（共刺激信號(hào)）。此外，dC也參與多種免疫病理過程（如炎癥、腫瘤和自身免疫病等）發(fā)生、發(fā)展。文獻(xiàn)已報(bào)道，細(xì)胞微環(huán)境酸化可促進(jìn)dC吞噬功能和抗原提呈（MH

3、C I 類分子途徑），但其確切機(jī)制尚不清楚。
　　 酸敏感離子通道（ASICs，acid-sensing ion channels）是一類H+門控的陽離子通道，屬上皮鈉通道/退化蛋白[ENaC(epithelial sodium channel)/DEG(degenerin)]家族。ASICs 主要表達(dá)于中樞和外周神經(jīng)元，與觸覺、學(xué)習(xí)記憶、痛覺和酸味覺形成有關(guān)。近年報(bào)道，非神經(jīng)細(xì)胞（平滑肌細(xì)胞和骨細(xì)胞）和淋巴細(xì)胞（T 細(xì)胞）也可

4、表達(dá)ASICs，后者參與相關(guān)細(xì)胞的功能調(diào)控。
　　 本研究以小鼠骨髓來源的dC為研究對(duì)象，擬探討重要的專職APC——DC是否表達(dá)ASICs，在此基礎(chǔ)上，觀察微環(huán)境酸化對(duì)DC的功能調(diào)控作用及其與ASICs的關(guān)系。
　　 一、DC表達(dá)功能性ASICs1.DC表達(dá)ASICs體外誘導(dǎo)BMDC分化，提取其總RNA和全蛋白，借助RT-PCR和Western blot證明：dC可表達(dá)ASIC1、ASIC2和ASIC3的mRNA和蛋白質(zhì)

5、。借助免疫熒光雙標(biāo)法和免疫電鏡膠體金法檢測(cè)ASIC 在dC內(nèi)的定位，結(jié)果顯示：ASIC1和ASIC3分別表達(dá)于dC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，細(xì)胞膜未見表達(dá)；而ASIC2 主要表達(dá)于胞膜。2．DC表面ASICs的電生理功能借助全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)dC所表達(dá)ASICs的電生理功能，結(jié)果顯示：細(xì)胞外pH6.0可激活dC胞膜表面ASICs 樣內(nèi)向電流，該電流包含早期快速激活和晚期慢速失活兩個(gè)時(shí)相，且能被ASICs 阻斷劑阿米洛利可逆性阻斷（n=6，p＜0.0

6、5）。pH6.0 激活的ASICs 樣電流具有如下特點(diǎn)：平均幅度為329.63±52.36 pA；該內(nèi)向電流具有pH依賴性：激活電流的最大pH值在7.0 左右，產(chǎn)生最大電流的pH值為5.0；pH50 為6.08±0.05，Hill系數(shù)為1.03±0.07（n=6）。
　　 二、細(xì)胞外酸化誘發(fā)的dC內(nèi)向電流依賴于ASICs1.細(xì)胞外酸化誘發(fā)的dC內(nèi)向電流不依賴于TRPV1瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1，transient r

7、eceptor potential vanilloid-1)亦稱VR1，屬非選擇性陽離子通道。細(xì)胞外pH值低于6.0，可在細(xì)胞膜產(chǎn)生內(nèi)向電流。以皮層神經(jīng)元為陽性對(duì)照，TRPV1 激動(dòng)劑辣椒素不能誘發(fā)dC產(chǎn)生TRPV1 電流，提示dC不表達(dá)功能性TRPV1。另外，借助RT-PCR 也未能在dC檢出TRPV1 mRNA表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：細(xì)胞外pH值降低誘發(fā)dC所產(chǎn)生的電流并非TRPV1 介導(dǎo)，其為ASICs 依賴性（見前述）。2.非甾

8、體抗炎藥抑制DC表面ASICs的電生理功能文獻(xiàn)報(bào)道，非甾體抗炎藥可抑制海馬和感覺神經(jīng)元ASICs的功能。本研究借助全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察非甾體抗炎藥（布洛芬和雙氯芬酸）對(duì)DC表面ASICs 電生理功能的影響。結(jié)果顯示：布洛芬（200 μM）和雙氯芬酸（200 μM）均可明顯降低DC的ASICs 電流（前者從364.17±57.15 pA 降低為176.07±28.77 pA，抑制率51.49±3.75％；后者從353.97±51.58

9、pA 降低為166.7±18.57 pA，抑制率51.67±8.3％），該抑制效應(yīng)為可逆性。上述結(jié)果提示，非甾體抗炎藥可抑制DC表面ASICs的電生理功能。
　　 三、細(xì)胞外酸化通過ASICs 調(diào)控dC功能1.細(xì)胞外酸化通過ASICs上調(diào)DC表面抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)用ASICs 阻斷劑阿米洛利（100 μM）預(yù)處理培養(yǎng)7天的DC（30 min,37℃，5％CO2），然后在pH6.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h（37℃,7％ CO2），流

10、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面CD11c、MHC II、CD80和CD86表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組（pH6.5 單獨(dú)刺激4 h）相比，阿米洛利可明顯抑制DC表面相關(guān)分子表達(dá)（n=6，p＜0.05），提示微環(huán)境酸化可通過ASICs 而調(diào)控DC表面抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)。2．非甾體抗炎藥通過抑制ASICs 功能而影響細(xì)胞外酸化對(duì)DC表面抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)，非甾體抗炎藥可抑制DC表面ASICs的電生理功能，提示其如同阿米洛利

11、，具有ASICs 阻斷劑的效應(yīng)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用非甾體抗炎藥探討細(xì)胞外酸化對(duì)DC表面抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用與ASICs的關(guān)系。培養(yǎng)7天的dC用非甾體抗炎藥布洛芬或雙氯芬酸（均為200 μM）預(yù)處理30 min（37℃，5％ CO2），然后在pH6.5 培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h（37℃,7％ CO2），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面分子CD11c、MHC II、CD80和CD86表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組（pH6.5 單獨(dú)刺激4 h）相比，布洛芬和雙氯

12、芬酸處理組的分子表達(dá)水平明顯降低（n=6，p＜0.05），提示細(xì)胞外酸化對(duì)DC表面抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用為ASICs 依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1．BMdC可表達(dá)功能性ASICs，后者參與細(xì)胞外酸化對(duì)DC表面抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 2．非甾體抗炎藥可調(diào)控DC表面ASICs的電生理功能，并影響微環(huán)境酸化對(duì)DC表面抗原提呈相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，提示ASICs 可能是非甾體抗炎藥發(fā)揮免疫抑