β-葡聚糖通過(guò)抑制NFIA的表達(dá)調(diào)控G-MDSCs功能.pdf

1、目的:利用來(lái)源于釀酒酵母的顆粒性β-葡聚糖(wholeβ-glucan paticles，WGP)作用于小鼠粒細(xì)胞樣髓源抑制性細(xì)胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells，G-MDSCs)，檢測(cè)G-MDSCs中核因子I-A(Nuclear Factor I-A，NFIA)表達(dá)情況，研究胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)分子的改變;體外通過(guò)RNAi技術(shù)抑制G-MDSCs中NFIA的表達(dá)，觀察細(xì)胞免疫抑制功能的

2、變化;觀察經(jīng)NFIA基因抑制的G-MDSCs對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　方法:
　　1.通過(guò)免疫磁珠分離技術(shù)分選出小鼠脾臟中G-MDSCs，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)檢測(cè) G-MDSCs中NFIA mRNA的表達(dá)情況。
　　2.體外使用WGP刺激G-MDSCs，通過(guò)qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)G-MDSCs

3、中NFIA的表達(dá)情況。
　　3.體外利用小鼠NFIA特異性siRNA抑制G-MDSCs中NFIA蛋白表達(dá)。隨后采用比色法定量檢測(cè)G-MDSCs中精氨酸酶1(Arginase-1，Argl)的活性，利用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)G-MDSCs中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的表達(dá)情況，利用[3H]TdR摻入試驗(yàn)檢測(cè)G-MDSCs的免疫抑制功能。
　　4.①體外利用特異性抗Dectin-1抗體阻斷

4、β-葡聚糖受體Dectin-1后，再使用WGP作用于G-MDSCs，通過(guò)qRT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)阻斷Dectin-1途徑后G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白的表達(dá)情況;②體外采用WGP刺激G-MDSCs，通過(guò)Westem-blot檢測(cè)Dectin-1下游信號(hào)分子c-jun的活化情況;③利用c-jun分子磷酸化抑制劑SP600125下調(diào)c-jun分子磷酸化水平，再使用WGP作用于G-MDSCs，通過(guò)qRT-P

5、CR和Western-blot分別檢測(cè)G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　5.將轉(zhuǎn)染NFIA特異性siRNA的G-MDSCs與Lewis肺癌細(xì)胞混合后皮下注射C57BL/6小鼠，連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)及小鼠生存率。
　　結(jié)果:
　　1.與野生型小鼠相比，從荷瘤小鼠脾臟分選出的G-MDSCs中NFIA mRNA表達(dá)水平升高44.0％(P＜0.05)。
　　2.通過(guò)qRT-PCR和Western-bl

6、ot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):WGP刺激48h后，G-MDSCs中NFIAmRNA表達(dá)水平下降88.2％(P＜0.001)，NFIA蛋白表達(dá)水平下降44.4％(P＜0.05)。
　　3.利用小鼠NFIA特異性siRNA抑制G-MDSCs中NFIA蛋白表達(dá)后，與對(duì)照組G-MDSCs中Arg1活性（6.339±0.5468 U/L）相比，siRNA處理組G-MDSCs中Arg1活性（3.482±0.3391 U/L）顯著下調(diào)(P＜0.01，n=6);

7、 ROS的表達(dá)未出現(xiàn)明顯變化;G-MDSCs免疫抑制功能實(shí)驗(yàn)表明，抑制G-MDSCs中NFIA表達(dá)可以下調(diào)G-MDSCs的免疫抑制功能(P＜0.05)。
　　4.①WGP可抑制G-MDSCs中NFIA的表達(dá)，阻斷Dectin-1途徑后再使用WGP作用于G-MDSCs，結(jié)果顯示:WGP對(duì)G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用減弱(P＜0.05，P＜0.01);②Western-blot結(jié)果顯示:WGP刺激30min后

8、，G-MDSCs中Dectin-1下游信號(hào)分子c-jun的磷酸化水平顯著升高(P＜0.001);③抑制c-jun分子磷酸化水平后再使用WGP作用于G-MDSCs，qRT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示:抑制c-jun分子磷酸化水平后，G-MDSCs中NFIA mRNA和蛋白的表達(dá)均恢復(fù)到較高水平(P＜0.01，P＜0.05)。
　　5.siNFIA組小鼠腫瘤體積在腫瘤植入后第19天、第21天和第23天均明顯小于對(duì)照組小鼠

9、。其中siNFIA組小鼠腫瘤體積在腫瘤植入后第19天為169.4±42.30 mm3、第21天為224.3±53.51 mm3、第23天為306.6±86.06 mm3，與此相對(duì)應(yīng)的，對(duì)照組小鼠腫瘤體積在腫瘤植入后第19天為403.3±35.57 mm3、第21天為608.4±49.97mm3、第23天為956.4±70.22 mm3。結(jié)果表明siNFIA組小鼠腫瘤生長(zhǎng)被有效延緩。同時(shí)還觀察到，相對(duì)于對(duì)照組小鼠，siNFIA組小鼠生存率