細(xì)胞色素P450-2J3基因干預(yù)對(duì)果糖誘導(dǎo)胰島素抗合并高血壓大鼠生理指標(biāo)的影響.pdf

1、第一部分高果糖誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗合并高血壓和高甘油三酯血癥 研究背景與目的：Hwang等首次報(bào)道高果糖飲食可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生高血壓。Zavarom和Tobey等研究發(fā)現(xiàn)，高果糖飲食也能引起大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗和高甘油三酯血癥。在確定果糖產(chǎn)生此效應(yīng)試驗(yàn)中，35-72％果糖飲食或者飲用10-15％果糖溶液誘導(dǎo)大鼠兩周以上均可以產(chǎn)生胰島素抵抗合并高血壓，高甘油三酯血癥。本部分試驗(yàn)主要在于使用高果糖飲食制作大鼠胰島素抵抗合并高血壓，高甘油三

2、酯血癥模型。 方法：雄性SD大鼠(30只)室溫馴養(yǎng)一周，隨機(jī)分為高果糖飲食組(12只)和正常飲食組(18只)。果糖飲食組食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用15％的果糖溶液，正常飲食組食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水。每周測量血壓一次，試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠第三周采取尾靜脈血液并分離血清，留取大鼠24小時(shí)尿液。采用臨床標(biāo)準(zhǔn)方法測定血脂，血胰島素，血糖濃度。胰島素抵抗指數(shù)(IR)按內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)模型技術(shù)(HOMA)計(jì)算。各項(xiàng)指標(biāo)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，

3、參數(shù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)果：果糖誘導(dǎo)3周后，果糖飲食組大鼠血壓明顯高于正常飲食組(135.5±0.6和119.4±0.7，P＜0.001)；果糖飲食組大鼠血胰島素及甘油三酯明顯升高，與正常飲食組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：高果糖飲食可以引起大鼠胰島素抵抗和高血壓，高甘油三酯血癥。果糖誘導(dǎo)的大鼠代謝綜合癥是較為理想的代謝綜合癥動(dòng)物模型之一。 第二部分CYP450-2J3基因的克隆及其在293細(xì)胞的

4、表達(dá) 研究背景與目的：花生四烯酸細(xì)胞色素P450(ArachidonicAcidCytochromeP450，CYP450)表氧化酶代謝產(chǎn)物表氧化二十碳三烯酸(EpoxyeicosatrienoicAcids，EETs)是繼一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)之后發(fā)現(xiàn)的又一種重要血管舒張因子。早期的研究發(fā)現(xiàn)，它通過激活鈣離子敏感的鉀通道，使平滑肌細(xì)胞處于超極化狀態(tài)而擴(kuò)張血管，而被認(rèn)為是內(nèi)皮源性超極化因子(Endothelium

5、-DerivedHyperpolaringFactor，EDHF)。內(nèi)皮來源的EETs也同樣可以激活K+Ca通道使平滑肌細(xì)胞超極化產(chǎn)生血管舒張效應(yīng)，這種類似的效應(yīng)使研究人員懷疑EETs和EDHF是同一種物質(zhì)。花生四烯酸經(jīng)細(xì)胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)表氧化酶代謝為四種EETs，分別為：5,6-EET、8,9-EET、11，12-EET和14,15-EET。細(xì)胞色素P450表氧化酶能夠以氧化和依賴NADPH

6、的方式氧化、過氧化和/或者還原膽固醇、維生素、類固醇與多種藥物。大鼠CYP2J3基因編碼的是分子量為57，969Da的末端含有亞鐵血紅素的細(xì)胞色素P450表氧化酶，屬于細(xì)胞色素P450超家族成員。這些細(xì)胞色素P450同工酶，如CYP2J2，CYP2J3能代謝花生四烯酸(arachidonicacid，AA)生成EETs。而這些化學(xué)物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血壓，舒張血管，調(diào)節(jié)細(xì)胞增值，炎癥，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面都起著重要作用。 我們采用RT-

7、PCR和OE-PCR技術(shù)成功克隆出CYP2J3基因，并將其亞克隆入pCDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，pCDNA3.1(+)-CYP2J3重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建，并在293細(xì)胞穩(wěn)定有效表達(dá)。為研究CYP2J3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。我們研究CYP450對(duì)于心血管系統(tǒng)保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行。 方法：提取大鼠肝臟組織總RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增出CYP2J3基因兩個(gè)片斷CYP2J3-A和CYP2J3-B，運(yùn)用重疊延伸聚合酶鏈

8、反應(yīng)(OE-PCR)擴(kuò)增大鼠CYP2J3基因ORF全長，經(jīng)過酶切堅(jiān)定和測序正確后，亞克隆入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用WesternBlotting鑒定其在293細(xì)胞有效表達(dá)。 結(jié)果：RT-PCR成功克隆出CYP2J3-A和CYP2J3-B兩片段；運(yùn)用重疊延伸PCR擴(kuò)增出CYP2J3基因開放式閱讀框(ORF)全長序列，測序結(jié)果顯示獲得ORF全長序列；pCDNA3.1(+)-CYP2J3的成功構(gòu)建

9、，然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果表明，CYP2J3基因能在293細(xì)胞穩(wěn)定有效表達(dá)。 結(jié)論：大鼠CYP2J3基因的成功克隆以及pCDNA3.1(+)-CYP2J3載體的成功構(gòu)建。為CYP2J3基因的功能研究和相關(guān)疾病的研究提供了可行的工具。 第三部分CYP2J3基因降低果糖誘導(dǎo)的大鼠高血壓并改善胰島素抵抗 研究背景與目的：最近的國內(nèi)外臨床觀察發(fā)現(xiàn)，高血壓患者常伴有胰島素抵抗甚至糖尿病，我們用高果糖溶液誘導(dǎo)出

10、了高血壓伴有胰島素抵抗的大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠血壓較對(duì)照組明顯升高(135.5±0.6和119.4±0.7，P＜0.001)；而血甘油三酯和胰島素水平也顯著升高，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)大鼠IR(HOMA)也明顯高于對(duì)照組(2.4±0.2和1.8±0.1，P＜0.05)；兩組血糖和膽固醇濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果顯示，高果糖誘導(dǎo)三周可以導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)明顯的血壓升高及高胰島素血癥，并產(chǎn)生胰島素抵抗。 最近的研究發(fā)現(xiàn)

11、，高果糖誘導(dǎo)動(dòng)物模型的高血壓與交感神經(jīng)活性增加及內(nèi)皮素系統(tǒng)紊亂有關(guān)。EETs目前被認(rèn)為就是一種EDHF，通過激活K+Ca通道使平滑肌細(xì)胞超極化產(chǎn)生血管舒張效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)血管張力降低血壓。有試驗(yàn)表明，CYP2J3和CYP2J2都可以代謝花生四烯酸生成EETs，而EETs能舒張血管并降低大鼠血壓。這些結(jié)果表明內(nèi)源性和外源性的EETs水平影響著血管張力并與血壓的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本試驗(yàn)主要探討CYP2J3基因干預(yù)能否降低高果糖誘導(dǎo)大鼠的高血壓，以

12、及高血壓大鼠的胰島素水平，從而改善胰島素抵抗。 方法：雄性SD大鼠飲用15％的果糖溶液誘導(dǎo)成高血壓和胰島素抵抗模型，經(jīng)尾靜脈注入pCDNA3.1-CYP2J3基因。大鼠血壓測量儀測量血壓，每周一次。果糖誘導(dǎo)第三周及基因注入后第二周分別留取大鼠尾靜脈血及24小時(shí)尿標(biāo)本，采用臨床標(biāo)準(zhǔn)方法測定血脂，血胰島素，血糖濃度。胰島素抵抗指數(shù)(IR)按內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)模型技術(shù)(HOMA)計(jì)算。 結(jié)果：高果糖誘導(dǎo)三周后，試驗(yàn)組大鼠血壓和胰島素均