孕激素不同種類及不同劑量對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)及出血有關(guān)基因表達(dá)影響的比較研究.pdf

1、背景：
　　 1/3的育齡婦女可發(fā)生子宮異常出血，婦女應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)劑量雌孕激素序貫治療初期，有將近一半出現(xiàn)不規(guī)則陰道出血。子宮內(nèi)膜出血的機(jī)制可能涉及局部介質(zhì)的調(diào)節(jié)、表達(dá)和信號(hào)處理的紊亂，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與血小板凝血酶敏感蛋白-1的比值改變（前血管生成因子/抗血管生成因子）；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)的改變；組織因子的改變；內(nèi)膜白細(xì)胞尤其是子宮自然殺傷細(xì)胞的增加等等。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白被多種酶降解

2、，但一般認(rèn)為MMPs是內(nèi)膜組織脫落和胚胎種植過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解和重建中最重要的酶之一，其活性在3個(gè)水平上被調(diào)控：轉(zhuǎn)錄、酶原的激活、被TIMPs的抑制。MMPs受卵巢性甾體激素控制的，但是，這種調(diào)控作用并不是直接的。內(nèi)膜出血相關(guān)因子(Lefty)通過(guò)抑制膠原合成、刺激MMPs生成以促進(jìn)膠原降解，來(lái)調(diào)節(jié)ECM的崩解。Lefty是一個(gè)抗TGF-β的細(xì)胞因子，可干擾TGF-β家族的其他成員的促進(jìn)子宮內(nèi)膜完整性作用，與胚胎植入和月經(jīng)期

3、內(nèi)膜組織脫落過(guò)程中的組織重建關(guān)系密切。已有研究提示異常出血時(shí)內(nèi)膜Lefty的表達(dá)增強(qiáng)，使MMPs的生成過(guò)量，繼而ECM與血管基底膜不適時(shí)的崩解。
　　 不同種類及劑量的孕激素對(duì)于各種出血問(wèn)題的治療效果，以及不同種類及劑量的孕激素應(yīng)用于性激素治療方案時(shí)出血模式存在細(xì)微的差別，而造成這種差別的原因尚不明了。本研究觀察不同種類及劑量的孕激素應(yīng)用期間和撤退后內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，檢測(cè)與出血有關(guān)基因的表達(dá)情況，試圖發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)觀察指標(biāo)在不同孕激素

4、處理組中可能存在的差異，以期將這些差異與臨床出血問(wèn)題相聯(lián)系，在一定程度上輔助臨床工作者選擇孕激素種類和劑量。
　　 目的：
　　 本研究以目前臨床常用的三種口服孕激素——微粉化黃體酮(MP)、地屈孕酮(DYD)和醋酸甲羥孕酮(MPA)應(yīng)用于雌激素預(yù)處理的去勢(shì)小鼠，觀察序貫應(yīng)用雌孕激素期間以及雌孕激素撤退后，子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、子宮組織與出血相關(guān)的6種基因的表達(dá)情況。向雌孕激素預(yù)處理的去勢(shì)小鼠子宮腔注射過(guò)濾除菌的花生油，觀

5、察不同孕激素組小鼠內(nèi)膜形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，檢測(cè)此期間小鼠子宮MMPs及TIMP-1的表達(dá)情況。
　　 內(nèi)容：
　　 1．第一部分觀察序貫經(jīng)皮下給予雌孕激素過(guò)程中去勢(shì)小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，檢測(cè)與出血有關(guān)基因的表達(dá)情況
　　 2．第二部分觀察不同種類不同劑量的口服孕激素作用于雌激素預(yù)處理的去勢(shì)小鼠時(shí)子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，檢測(cè)與出血有關(guān)的基因表達(dá)的情況
　　 3．第三部分向雌激素與不同孕激素預(yù)處理的去勢(shì)小鼠子宮腔內(nèi)注

6、射花生油，觀察內(nèi)膜形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，檢測(cè)MMPs及TIMP-1基因表達(dá)的情況
　　 方法：
　　 1．實(shí)驗(yàn)對(duì)象：8周齡雌性C57BL/6小鼠
　　 2．給藥流程：
　　 2.1.各個(gè)序貫給予雌孕激素組：去勢(shì)成功小鼠，第1、2、3天皮下注射17β-雌二醇(17β-E2)100ng，第4、5、6天不予處理，第7、8、9天皮下注射17β-E25ng合并不同劑量不同種類的孕激素；
　　 2.2.溶劑對(duì)照組1（去

7、勢(shì)溶劑組）：去勢(shì)成功小鼠，第1-9天操作流程與2.1所述相同，但僅注射或灌胃溶劑。
　　 2.3.溶劑對(duì)照組2（假去勢(shì)溶劑組）：假去勢(shì)小鼠，第1-9天操作流程與2.1所述相同，但僅注射或灌胃溶劑。
　　 3．實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組：
　　 3.1.第一部分：共36只小鼠，分4組，1～3組每組6只，分別為去勢(shì)溶劑組、假去勢(shì)油劑組和100ng17β-E272h組，第4組為序貫經(jīng)皮下給予雌、孕激素（孕酮）組，又分為3亞組，每組6

8、只，分別為皮下注射孕酮一次后24h取材組（皮下首次24h組）；每天一次、連續(xù)3天、末次注射后24h取材組（皮下末次24h組）；每天一次、連續(xù)3天、末次注射后48h取材組（皮下末次48h組）。
　　 3.2.第二部分：共126只小鼠，分組如下：
　　 ·微粉化黃體酮0.4mg/只組（MP0.4mg組）
　　 ·微粉化黃體酮0.8mg/只組（MP0.8mg組）
　　 ·微粉化黃體酮1.2mg/只組（MP1.2

9、mg組）
　　 ·地屈孕酮0.04mg/只組（DYD0.04mg組）
　　 ·地屈孕酮0.08mg/只組（DYD0.08mg組）
　　 ·醋酸甲羥孕酮0.016mg/只組（MPA0.016mg組）
　　 ·醋酸甲羥孕酮0.025mg/只組（MPA0.025mg組）
　　 每組再分3個(gè)亞組，分別為灌胃1次后24h取材組（灌胃首次24h組）；每天一次、連續(xù)3天、末次灌胃后24h取材組（灌胃末次24h組

10、）；每天一次、連續(xù)3天、末次灌胃后48h取材組（灌胃末次48h組）。
　　 3.3.第三部分：共48只小鼠，分8組，每組6只。序貫給予雌孕激素方案及給藥途徑與研究第1、2部分一致，在末次應(yīng)用孕激素后4h，向小鼠子宮腔注射20μl過(guò)濾除菌的花生油，并在末次應(yīng)用孕激素后48h取材（皮下末次48h組（打油）或灌胃末次48h組（打油））。
　　 4．觀察指標(biāo)：
　　 4.1.子宮濕重
　　 4.2.血清E2和孕酮

11、濃度
　　 4.3.子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)表現(xiàn)
　　 4.4.ERa和PR在內(nèi)膜的組織學(xué)定位
　　 4.5.子宮ERa、PR、Lefty、MMP3、MMP9及TIMP-1的表達(dá)
　　 結(jié)果：
　　 1．子宮濕重：取材時(shí)，鼠齡約11～12周，體重約209。
　　 1.1.研究第一部分：去勢(shì)溶劑組、假去勢(shì)溶劑組和100ng17β-E272h組的小鼠子宮濕重平均為11.28mg、32.03mg和34.4

12、6mg，經(jīng)皮注射雌孕激素組的三個(gè)亞組子宮濕重分別為34.92mg、32.78mg和30.83mg，去勢(shì)溶劑組小鼠子宮濕重顯著低于其余各組(P=0.000)，而其余各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　 1.2.研究第二部分：7個(gè)口服孕激素組的21個(gè)亞組小鼠子宮濕重在28.51～39.04mg之間，MP1.2組中的灌胃末次24h亞組的小鼠子宮濕重為28.51mg，顯著低于其他各亞組（P＜0.01），而其余各亞組間無(wú)顯著差異（P＞

13、0.05）。
　　 1.3.研究第三部分：皮下末次48h組（打油）和灌胃末次48h組（打油）小鼠子宮濕重在20.8～24.94之間，組間無(wú)顯著差異(P=0.225)，但顯著低于各自對(duì)應(yīng)的未打油的末次應(yīng)用孕激素48h組小鼠子宮濕重(P＜0.001)。
　　 2．血清雌孕激素水平：
　　 2.1.血清E2：100ng17β-E272h組小鼠血清雌二醇水平在700pg/ml左右，而應(yīng)用5ng17β-E2期間，則雌二醇維

14、持于120pg/ml左右，顯著高于5ng17β-E2末次應(yīng)用48h后（29.66pg/ml，P=0.000）和去勢(shì)溶劑組(15.8pg/ml，P=0.000)。假去勢(shì)組小鼠的血清雌二醇濃度在94.85～364.20pg/ml之間。
　　 2.2.血清孕酮：在皮下注射500μg孕酮組及MP1.2mg灌胃組，用藥期間小鼠血清孕酮在150nmol/L左右，應(yīng)用MP0.4mg和MP0.8mg期間，小鼠血清孕酮在30～60nmol/L之間

15、，末次用藥48h孕酮水平均顯著下降。應(yīng)用DYD和MPA的各組小鼠血清孕酮均低于10nmol/L。
　　 3．子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)表現(xiàn)：
　　 3.1.研究第一部分：100ng17β-E272h組小鼠子宮內(nèi)膜腔上皮和腺體均呈增殖樣表現(xiàn)，間質(zhì)較水腫明顯；皮下首次24h組小鼠內(nèi)膜腔上皮和腺體為增殖樣表現(xiàn),間質(zhì)致密，其中1只小鼠內(nèi)膜出現(xiàn)分泌樣改變(1／6)；皮下末次24h組小鼠子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)均呈分泌樣改變(5/5)。
　　

16、 3.2.研究第二部分：孕激素末次灌胃24h時(shí)，MP1.2mg組雌激素預(yù)處理的內(nèi)膜由增殖樣轉(zhuǎn)化為分泌樣的比例為2/5，另3只小鼠內(nèi)膜大部分呈分泌樣改變而局部有輕度萎縮表現(xiàn)；MP0.8mg組和DYD0.08mg組小鼠內(nèi)膜均由增殖樣轉(zhuǎn)化為分泌樣表現(xiàn)；MP0.4mg組、MPA0.016mg組、DYD0.04mg組內(nèi)膜轉(zhuǎn)化比例分別為2/5、4/6和5/6。分泌樣內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)在不同種類孕激素組間未呈現(xiàn)明顯差別。
　　 3.3.研究第三

17、部分：向雌孕激素預(yù)處理的去勢(shì)小鼠子宮腔注射油劑后，部分小鼠內(nèi)膜局部血管周圍基質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)前蛻膜樣改變，其中，皮下注射孕酮組5只小鼠中有3只局部出現(xiàn)前蛻膜樣細(xì)胞，MP0.8mg組、MP1.2mg組和DYD0.08mg組均有2/5小鼠內(nèi)膜出現(xiàn)前蛻膜樣細(xì)胞，而其余各組僅有1/5～1/6出現(xiàn)前蛻膜樣細(xì)胞。各組均未見典型的內(nèi)膜脫落表現(xiàn)。
　　 4．序貫應(yīng)用雌孕激素過(guò)程中，ERα定位于上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞胞核，孕激素首次應(yīng)用24h時(shí)胞核著色最深

18、，陽(yáng)性細(xì)胞最多；而PR僅在聯(lián)合應(yīng)用雌孕激素過(guò)程中的基質(zhì)細(xì)胞胞漿著色，且著色強(qiáng)度較低。
　　 5．子宮組織ERα基因的表達(dá)情況：
　　 5.1.研究第一部分：ERα表達(dá)量在100ng17β-E272h組最低，而在去勢(shì)溶劑組最高，而假去勢(shì)溶劑組和序貫經(jīng)皮注射雌孕激素（孕酮）組的三個(gè)亞組ERα的表達(dá)水平之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　 5.2.研究第二部分：ERα在MP1.2mg、MPA0.025mg和DYD0.

19、08mg應(yīng)用期間的表達(dá)量持續(xù)較低，與經(jīng)皮孕酮組相近，而ERα表達(dá)量在MP0.4mg/0.8mg應(yīng)用期間，隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低（P=0.000vsP=0.018），上述5組孕激素撤退后ERα的表達(dá)量均升高；MPA0.016mg組ERa表達(dá)量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(p=0.013)。
　　 6．子宮組織PR基因的表達(dá)情況：
　　 6.1.研究第一部分：PR在去勢(shì)溶劑組、假去勢(shì)溶劑組和100ng17β-E272h組的表達(dá)量均較低，組

20、間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；PR在皮下首次24h組表達(dá)水平最高，隨孕酮應(yīng)用72h時(shí)PR表達(dá)量下降，但差異無(wú)顯著意義(P=0.522)，至皮下末次48h時(shí)PR表達(dá)量顯著下降（P=0.020）。
　　 6.2.研究第二部分：PR在MPA0.8mg、MPA0.016mg和MPA0.025mg應(yīng)用及撤退期間的表達(dá)模式與皮下孕酮組相似，撤藥后表達(dá)量顯著降低(P值分別為0.004、0.000和0.000)；在MP1.2mg和DYD0.08

21、mg應(yīng)用期間，PR表達(dá)量顯著下降（P=0.029vsP=0.003）；MP0.4mg和DYD0.04mg組，用藥及撤藥期間PR表達(dá)量均無(wú)顯著改變（P＞0.05）。
　　 7．子宮組織Lefty基因的表達(dá)情況：
　　 7.1.研究第一部分：Lefty在假去勢(shì)溶劑組表達(dá)量最低，與之相比，100ng17β-E272h組、皮下首次24h組和皮下末次24h組的表達(dá)量較高，但后3組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。孕酮撤退后，Lefty

22、表達(dá)量進(jìn)一步顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)皮孕酮撤藥后Lefty的表達(dá)量是末次24h時(shí)Lefty表達(dá)量的1.54倍。
　　 7.2.研究第二部分：Lefty在MP1.2mg和MPA0.025mg應(yīng)用期間和撤藥后的表達(dá)量均無(wú)顯著改變（P＞0.05）。應(yīng)用MP0.8mg和DYD0.08mg期間Lefty的表達(dá)量顯著下降（P=0.008vsP=0.049），而應(yīng)用MP0.4mg、DYD0.04mg和MPA0.016mg期間Lefty表達(dá)

23、量無(wú)顯著改變(P值分別為0.985、0.275和0.277)，但這5個(gè)劑量的孕激素撤退后，Lefty表達(dá)均顯著升高（P＜0.01）。MP0.8mg、DYD0.08mg和MPA0.016mg撤藥后Lefty表達(dá)量是灌胃末次24h時(shí)的2.31倍、3.99倍和2.81倍；而MP1.2mg組和MPA0.25mg組為1.15倍和0.97倍；MP0.8mg和DYD0.04mg組分別為1.59倍和1.67倍。
　　 8．子宮組織MMP3/MM

24、P9/TIMP-1基因的表達(dá)：
　　 8.1.研究第一部分：
　　 (A)MMP3在去勢(shì)溶劑組、假去勢(shì)溶劑組和100ng17β-E272h紐的表達(dá)量均較低(P＞0.05)，皮下首次24h組和皮下末次24h組與之相比，MMP3表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），而孕酮撤退后，MMP3的表達(dá)量顯著高于本部分研究中其他各組（P＜0.01）。經(jīng)皮孕酮撤退后MMP3表達(dá)量是經(jīng)皮末次24h時(shí)的1.95倍。
　　 (B)假去勢(shì)溶劑

25、組、100ng17β-E272h組及皮下注射孕酮期間的MMP9表達(dá)量均較低，組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），均顯著低于孕酮撤退后的MMP9表達(dá)水平（P值分別為0.000、0.002、0.000和0.001）。經(jīng)皮孕酮撤退后MMP9表達(dá)量是經(jīng)皮末次24h的1.78倍。經(jīng)皮孕酮撤退后MMP3表達(dá)量是經(jīng)皮末次24h的1.95倍。
　　 (C)去勢(shì)溶劑組和假去勢(shì)溶劑組小鼠子宮TIMP-1的表達(dá)量均較低，而應(yīng)用性甾體激素后，包括單雌激素或

26、雌孕激素聯(lián)合應(yīng)用，TIMP-1表達(dá)量升高，且隨孕激素應(yīng)用時(shí)間延長(zhǎng)而進(jìn)一步升高(P=0.022)。
　　 8.2.研究第二部分：
　　 (A)MMP3基因的表達(dá)在MP0.8mg組、MP1.2mg組和DYD0.08mg組用藥期間和撤藥后的表達(dá)模式一致，即應(yīng)用期間表達(dá)水平無(wú)顯著改變（P值分別為0.527、0.480和0.303）而撤藥后表達(dá)水平顯著升高（P值分別為0.002、0.006和0.000）；MMP3的表達(dá)量隨著應(yīng)用M

27、PA0.016/0.025mg的時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高（P=0.000vsP=0.043），而撤藥短期內(nèi)MMP3表達(dá)量的改變并不顯著。MP1.2mg撤退后MMP3表達(dá)量是灌胃末次24h的4.73倍；MP0.8mg組和DYD0.08mg組分別為2.07倍和2.25倍；MP0.4mg組和MPA0.025mg分別為1.36倍和1.14倍。
　　 (B)各種劑量孕激素應(yīng)用期間MMP9表達(dá)量均無(wú)顯著改變，但MP0.4mg/0.8mg組、MPA

28、組和DYD0.04mg組，停藥后表達(dá)量升高；而MP1.2mg和DYD0.08mg組停藥后MMP9的表達(dá)量亦無(wú)顯著改變。MP0.8mg/1.2mg、MPA0.016mg／0.025mg撤退后MMP9表達(dá)量是灌胃末次24h的2.93倍、2.99倍、2.32倍和2.39倍；MP1.2mg、DYD0.04mg和DYD0.08mg分別為1.24倍、1.14倍和1.28倍。
　　 (C)TIMP-1的表達(dá)量各種類、各劑量口服孕激素應(yīng)用期間均

29、無(wú)顯著改變，但DYD0.08mg、MPA0.016mg、MPA0.025mg撤藥后TIMP-1的表達(dá)量顯著升高(P值分別為0.000、0.007和0.002)。
　　 8.3研究第三部分：宮腔打油后小鼠子宮MMP3表達(dá)量升高出現(xiàn)在MPA0.025mg組、MP0.4mg/0.8mg/l.2mg組，MMP9表達(dá)升高出現(xiàn)在MP0.4mg/0.8mg組，而TIMP-1表達(dá)量的升高僅出現(xiàn)在MP0.8mg組。
　　 結(jié)論：
　

30、　 1．不同種類及劑量的孕激素與雌激素聯(lián)合應(yīng)用均可使去勢(shì)小鼠子宮濕重增加，但較高劑量MP組子宮濕重低于其他孕激素組。
　　 2．不同種類及劑量的孕激素應(yīng)用72h時(shí)均能夠使雌激素預(yù)處理的去勢(shì)小鼠子宮內(nèi)膜由增殖轉(zhuǎn)為分泌或輕度萎縮，較高劑量組的轉(zhuǎn)化比例高于較低劑量組。
　　 3．孕激素首次應(yīng)用24h時(shí)ERa和PR在子宮內(nèi)膜的免疫染色最強(qiáng)，隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)，ERa和PR的染色均降低。
　　 4．較低劑量孕激素應(yīng)用期間對(duì)

31、小鼠子宮組織ERα、PR、Lefty、MMP3基因表達(dá)的抑制作用較弱；而較高劑量對(duì)內(nèi)膜基因表達(dá)的抑制作用較強(qiáng)，以至于未出現(xiàn)撤藥后相關(guān)基因（如Lefty、MMP3、MMP9）表達(dá)升高的表現(xiàn)。孕激素對(duì)Lefty和MMPs表達(dá)抑制作用的強(qiáng)弱可能與內(nèi)膜不規(guī)則出血發(fā)生情況有關(guān)，推測(cè)應(yīng)用較低劑量孕激素可能更易發(fā)生出血。
　　 5．向雌孕激素方案預(yù)處理后的小鼠子宮腔注射油劑內(nèi)膜出現(xiàn)蛻膜樣細(xì)胞，但程度及范圍均很小，應(yīng)用較高劑量孕激素組小鼠內(nèi)膜出