泛素結(jié)合酶基因UbcH10調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬通過(guò)觀察UbcH10在不同病理級(jí)別腦膠質(zhì)瘤以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的確切表達(dá)情況,并通過(guò)敲減UbcH10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá),研究UbcH10在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能角色。實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分：第一部分,觀察UbcH10在腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平以及與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的相關(guān)性；第二部分,觀察UbcH10在U251和SHG-44腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的mRNA和蛋白表達(dá)水平及其與膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的關(guān)系；第三部分,通過(guò)RNA干

2、擾的方法敲減UbcH10的表達(dá)觀察其對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、凋亡等細(xì)胞表型的影響。 第一部分 泛素結(jié)合酶基因UbcH10在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)研究 目的：研究UbcH10在腦膠質(zhì)瘤組織中的mRNA剪切形式、mRNA和蛋白表達(dá)水平及其與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的相關(guān)性。 方法：根據(jù)UbcH10的cDNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,應(yīng)用RT-PCR和直接測(cè)序的方法檢測(cè)UbcH10 mRNA的不同剪切形式在32例不同級(jí)別腦星形膠質(zhì)細(xì)胞

3、瘤和6例正常腦組織中的表達(dá)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UbcH10 mRNA在上述組織標(biāo)本中的相對(duì)表達(dá)水平,應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)UbcH10在55例腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織和7例正常腦組織中的蛋白表達(dá)水平,并檢測(cè)UbcH10蛋白與增殖抗原Ki-67表達(dá)的相關(guān)性,最后應(yīng)用免疫熒光雙重染色技術(shù)獲取UbcH10蛋白的細(xì)胞定位信息。 結(jié)果：32例腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和6例正常腦組織mRNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得450bp左右產(chǎn)物,經(jīng)直接

4、測(cè)序證實(shí)與UbcH10 splice vl序列一致(GenBankaccession nos.NM 007019)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果提示UbcH10 mRNA表達(dá)水平在星形膠質(zhì)瘤組織中明顯上調(diào),與正常腦組織相比差別顯著(44.33±55.32 vs 1.00±1.57;P=0.000)。并且,UbcH10 mRNA水平在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤,二者相比差異顯著(64.33±60.98 vs 8.36±8.

5、15;p=0.000)。相似地,免疫組織化學(xué)染色提示UbcH10蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào),與正常腦組織相比差別顯著(7.90±5.70％vs 0.0±0.0％；P=0.000),且高、低級(jí)別膠質(zhì)瘤之間差別顯著(10.53±5.79％vs 4.23±2.85％；P=0.000),UbcH10陽(yáng)性細(xì)胞染色率與增殖抗原Ki-67蛋白表達(dá)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系(Spearman r=0.63,P<0.001)。雙重免疫熒光染色提示Ub

6、cH10蛋白與GFAP蛋白共定位于膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿。 結(jié)論:UbcH10以splice vl mRNA剪切形式表達(dá)于所有被檢測(cè)的星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤和正常腦組織中,但其在星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常腦組織,并和膠質(zhì)瘤病理級(jí)別以及增殖抗原Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)性,提示UbcH10可能在星形膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展惡變過(guò)程中具有重要作用。 第二部分 UbcH10在U251,SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)及其與細(xì)

7、胞周期的關(guān)系 目的：研究泛素結(jié)合酶UbcH10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和SHG-44中的mRNA、蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞亞定位水平；研究UbcH10蛋白在不同細(xì)胞周期的表達(dá)及與細(xì)胞周期蛋白CyclinA、Cyclin B1的關(guān)系。 方法：應(yīng)用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法檢測(cè)UbcH10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和SHG-44中的mRNA剪切形式和表達(dá)水平,應(yīng)用細(xì)胞免疫組化、蛋白印跡等方法研究UbcH10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的

8、蛋白表達(dá)水平,應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)UbcH10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的細(xì)胞亞定位水平及其與Ki67蛋白的定位關(guān)系。采用無(wú)血清饑餓、胸腺嘧啶阻斷和Nocodazole等方法分別同步化細(xì)胞于G0、G1/S和G2/M期,應(yīng)用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)UbcH10在上述不同細(xì)胞周期的表達(dá)情況及其與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin A、Cyclin B1的相互關(guān)系。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和直接測(cè)序發(fā)現(xiàn)UbcH10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的mRNA剪切形式為splice

9、 vl(GenBank accession nos.NM 007019)。熒光定量RT-PCR結(jié)果提示UbcH10 mRNA表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和SHG-44中明顯上調(diào),與正常腦組織相比差別顯著(33.77±21.54,30.20±20.13 vs 1.00±1.57;P=0.000)。免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光染色提示UbcH10蛋白主要表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿,并且部分表達(dá)UbcH10細(xì)胞亦表達(dá)增殖抗原Ki67,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證

10、實(shí)其在U251和SHG-44細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織(0.40±0.23 vs 0.0±0.0;P<0.05)。UbcH10主要表達(dá)于G2/M期,在G0,G1/S期表達(dá)甚少。自雙胸腺嘧啶阻斷釋放后,UbcH10的表達(dá)逐漸升高,在G2/M期達(dá)到高峰,并與細(xì)胞周期蛋白CyclinA、Cyclin B1呈消長(zhǎng)關(guān)系；自Nocodazole阻斷釋放后,UbcH10表達(dá)逐漸下降,細(xì)胞周期蛋白CyclinA、Cyclin B1表達(dá)亦逐漸下

11、降。 結(jié)論:UbcH10以splice vl mRNA剪切形式表達(dá)于所有被檢測(cè)的星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,其mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于正常腦組織,UbcH10在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)與細(xì)胞周期密切相關(guān),在G2/M期達(dá)到峰值。 第三部分 靶向UbcH10的RNA干擾對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、凋亡和細(xì)胞周期改變的作用 目的：研究靶向UbcH10的RNA干擾對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株增殖、凋亡的作用。 方法：設(shè)計(jì)并合

12、成靶向UbcH10的siRNA,脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染后24、48、72和96-小時(shí)U251細(xì)胞增殖率,Annexin/PI雙染測(cè)定干擾后24、48和72小時(shí)早期凋亡細(xì)胞比例和細(xì)胞周期改變,TUNEL原位檢測(cè)UbcH10 siRNA 48h后凋亡細(xì)胞比例,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染后48小時(shí)CyclinA、Cyctin B1、PCNA、Bax、Bcl-2、P53等蛋白表達(dá)水平變化。 結(jié)果:Ubc

13、H10 siRNA可有效敲減U251細(xì)胞UbcH10的表達(dá)。MTT法檢測(cè)UbcH10siRNA轉(zhuǎn)染組24,48,72和96小時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)吸光值分別為0.060±0.009,0.082±0.010,0.139±0.028,0.235±0.045;較陰性對(duì)照組(0.115±0.026,0.217±0.038,0.381±0.040,0.646±0.077)和未轉(zhuǎn)染組(0.101±0.017,0.215±0.048,0.390±0.047,0

14、.747±0.126)降低；其中24、48、72和96小時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),24,48,72小時(shí)靶向siRNA轉(zhuǎn)染引起U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率分別為22.70±8.83％,12.37±2.14％和5.97±1.20％,陰性對(duì)照組為8.00±1.67％,4.63±1.45％和5.77±1.34％,未轉(zhuǎn)染組為4.07±1.06％,4.60±1.01％和4.27±0.90％。在24、

15、48d,時(shí),早期凋亡比例均高于對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組,兩者之間差異顯著(P<0.05)。靶向UbcH10 siRNA轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞484,時(shí)后G2/M期細(xì)胞比例顯著升高,較陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組差異顯著(37.53±2.04％vs 18.01±1.60％,18.62±0.69％;P<0.05)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示,在UbcH10 siRNA轉(zhuǎn)染組中,有散在分布的陽(yáng)性染色細(xì)胞,其比例明顯高于陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染組(26.75±7.56％vs

16、7.64±3.75％,4.33±2.10％,P<0.05)。敲減UbcH10的表達(dá)后,Cyclin A的表達(dá)在干擾后出現(xiàn)升高,與對(duì)照組相比差異顯著；Cyclin B1的表達(dá)在干擾后亦出現(xiàn)升高趨勢(shì)；PCNA的表達(dá)在干擾后即下降,并且持續(xù)至干擾后72d,時(shí),與對(duì)照組相比差異顯著；Bax的表達(dá)在干擾后出現(xiàn)升高,Bcl-2的表達(dá)在干擾后24至48d,時(shí)出現(xiàn)降低,與對(duì)照組相比差異顯著；P53的表達(dá)在干擾后出現(xiàn)升高,與對(duì)照組相比差異顯著,p-P53

17、的表達(dá)在干擾后亦出現(xiàn)升高趨勢(shì),48和72d,時(shí)與對(duì)照組相比差異顯著。然而,Akt、p-Akt、P38、p-P38、c-Jun和P-c-Jun等蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變。 結(jié)論：通過(guò)RNA干擾敲減UbcH10在U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,其可能原因是通過(guò)減少cyclin A和cyclin B1的降解,由此導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯；敲減UbcH10表達(dá)可促進(jìn)P53、Bax蛋白的表達(dá),并抑制Bel-2的表達(dá),由此促進(jìn)膠