泛素結合酶UbcH10作為大腸癌診治標志物可行性的實驗研究.pdf

1、泛素結合酶UbcH10又稱周期蛋白選擇性泛素載體蛋白E2-C,屬于泛素結合酶E2家族的成員。在細胞周期調(diào)控過程中,UbcH10通過與具有E3連接酶活性的細胞后期促進復合物APC相互作用,影響有絲分裂紡錘體裝配檢測點驅(qū)動細胞周期的進展。在泛素介導的蛋白質(zhì)降解途徑中,E2蛋白的作用是通過其活性位點的半胱氨酸與來自E1活化酶的泛素以硫酯鍵相連,形成Ub-E2中間體,然后直接轉(zhuǎn)移或通過E3連接酶轉(zhuǎn)移泛素至靶蛋白,泛素化的靶蛋白被26s蛋白酶體識

2、別而降解。泛素蛋白酶體系統(tǒng)具有多種生理調(diào)控功能,該系統(tǒng)功能失常能引起包括腫瘤在內(nèi)的多種病理損害。Yoshiaki Okamoto等在研究泛素結合酶E2家族成員對腫瘤發(fā)生的潛在作用時,指出UbcH10是腫瘤相關性泛素結合酶。隨著一些與泛素蛋白酶體途徑相關致病蛋白的發(fā)現(xiàn)以及蛋白酶抑制劑Bortezomib對多發(fā)性骨髓瘤治療調(diào)控的認可,特異性干涉UP-S的某一環(huán)節(jié)已被認為足一種很有前途的創(chuàng)新性抗腫瘤治療方法。
　　 大腸癌包括直腸癌和

3、結腸癌,是常見的惡性腫瘤之一,在發(fā)達國家大腸癌已成為死亡率位居第2位的惡性腫瘤。近日,由中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學協(xié)作專業(yè)委員會公布的最新數(shù)據(jù)表明大腸癌在我國目前總?cè)巳旱陌l(fā)病率為十萬分之二十,發(fā)病率占常見腫瘤的第四位,2008年上海市大腸癌的發(fā)病率占惡性腫瘤的第二位。而且,近年來發(fā)病率上升趨勢十分明顯。目前治療大腸癌首選手術以及術后常規(guī)化療,手術后5年生存率不到40％?；熀头暖煹穆?lián)合應用取得一定療效,也不十分令人滿意。因此尋找一種新型非手

4、術干預的治療方法對于大腸癌的預防和治療具有非常重要意義。
　　 本研究中,我們首先檢測了UbcH10在大腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織的表達,統(tǒng)計分析了UbcH10與臨床病理學特征的相關性。結果表明UbcH10在大腸癌患者腫瘤組織中過度表達,并與腫瘤的分化程度及淋巴結轉(zhuǎn)移相關。隨后我們構建了UbcH10及其siRNA真核表達載體,在細胞學水平上證實了UbcH10過表達能促進大腸癌細胞的增殖和侵襲能力,基因沉默UocH10則能抑制大腸

5、癌細胞的增殖和侵襲能力。我們對細胞周期檢測的結果表明UbcH10的表達能影響細胞周期分布,這也是對UbcH10表達影響細胞增殖的進一步證實。最后,我們采用裸鼠皮下移植瘤模型研究了shRNA沉默UbcH10基因?qū)w內(nèi)大腸癌生長的抑制作用。研究結果為大腸癌的基因診斷及基因治療的研究提供了理論依據(jù)和技術對策。
　　 第一部分大腸癌組織中UbcH10的表達及臨床病理資料分析
　　 實驗目的:檢測泛素結合酶UbcH10在大腸癌組織

6、中的表達,分析UbcH10與大腸癌臨床病理學特征的相關性,探討UbcH10作為大腸癌診斷標志物的可行性。
　　 實驗方法:
　　 1.收集手術切除的原發(fā)性結直腸癌患者腫瘤組織標本及相應癌旁正常組織(距離腫瘤組織邊緣>5cm)凍存于-80℃冰箱。
　　 2.采用TRIzol一步法抽提組織總RNA,RT-PCR獲得UbcH10 cDNA,實時熒光定量PCR檢測大腸癌患者腫瘤組織與相應癌旁正常組織中UbcH10 mRN

7、A的豐度。
　　 3.S-P(鏈霉卵蛋白-辣根過氧化物酶)免疫組化染色分析大腸癌組織中UbcH10的表達。
　　 4.統(tǒng)計分析UbcH10表達與大腸癌臨床病理學特征的相關性。
　　 實驗結果:
　　 1.所有腫瘤組織樣本中UbcH10 mRNA豐度均明顯高于癌旁正常組織樣本的UbcH10 mRNA豐度(p<0.01)。
　　 2.與癌旁正常組織相比,大腸癌組織中產(chǎn)UbcH10蛋白表達明顯增強(p<

8、0.01)。
　　 3.大腸癌組織中UoeH10的表達與腫瘤的分化程度呈負相關,與淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關(p<0.05)。
　　 結論:UbcH10基因在大腸癌患者腫瘤組織中過度表達,并與腫瘤的分化程度及淋巴結轉(zhuǎn)移相關,提示UbcH10基因表達可作為大腸癌診斷的潛在腫瘤標記物及大腸癌基因治療的靶點。
　　 第二部分 UbcH10及其siRNA真核表達載體的構建
　　 實驗目的:構建UbcH10基因及其siRN

9、A真核表達載體。
　　 實驗方法:
　　 1.應用RT-PCR方法擴增出UbcH10 mRNA559bp的基因片斷,插入pMD-18T載體中,經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ酶切回收,插入真核表達載體pcDNA3.1形成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-UbcH10。
　　 2.參考文獻報道設計UbcH10基因的siRNA片段,表達載體pGPU6/GFP/Neo/siRNA-UbcH10的合成與構建由上海吉瑪制約技術有限公司完成

10、。
　　 3.表達載體pcDNA3.1-UbcH10、pGPU6/GFP/Neo/siRNA-UbcH10)及其對照轉(zhuǎn)染大腸癌細胞后,Western blot分析證實UbcH10及其siRNA真核表達載體的有效性。
　　 實驗結果:
　　 1.測序證實RT-PCR方法從大腸癌細胞擴增出559bp的UbcH10片斷序列正確。
　　 2.對轉(zhuǎn)染細胞行Western blot分析表明:與對照組相比,pcDNA3

11、.1-UbcH10組UbcH10蛋白表達明顯增強:pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA組UbcH10蛋白表達下調(diào)。
　　 結論:成功構建了UbcH10及其siRNA真核表達載體,為進一步研究UbcH10基因表達作為大腸癌診治靶標的可行性提供了必要的工具。
　　 第三部分 UbcH10基因表達對大腸癌細胞增殖活性及侵襲能力影響的體外研究
　　 實驗目的:研究pcDNA3.1-UbcH10和pGPU6

12、/GFP/Neo/UbcH10-siRNA調(diào)控的UbcH10表達改變對大腸癌細胞增殖、侵襲能力以及細胞周期分布的影響。
　　 實驗方法:
　　 1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA、pcDNA3.1-UbcH10及其相應空載體分別轉(zhuǎn)染大腸癌細胞HT-29及LoVo,采用FACS和熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染細胞中GFP表達,以測定大腸癌HT-29和LoVo細胞的基因轉(zhuǎn)染效率。
　　 2

13、.采用細胞增殖活性分析試劑盒Cell Kounting Kit-8(CCK-8)檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-UbcH10、pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA及其相應對照載體的大腸癌細胞的增殖能力。
　　 3.采用流式細胞術檢測pcDNA3.1-UbcH10和pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA對HT-29和LoVo細胞周期分布的影響。
　　 4.采用Matrigel侵襲實驗分析UbcH10

14、對大腸癌細胞侵襲活性的影響。
　　 實驗結果:
　　 1.基因轉(zhuǎn)染效率實驗結果顯示:轉(zhuǎn)染48小時后GFP表達陽性細胞超過50％,72小時GFP表達陽性細胞接近80％。
　　 2.與對照組相比,pcDNA3.1-UbcH10轉(zhuǎn)染組大腸癌細胞增殖和侵襲能力明顯增強；而pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA轉(zhuǎn)染組大腸癌細胞增殖和侵襲能力明顯減弱。
　　 3.流式細胞術結果顯示:pcDNA3.1-U

15、bcH10轉(zhuǎn)染組大腸癌細胞周期分布在G2/M期明顯減少,而pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA轉(zhuǎn)染組大腸癌細胞在G2/M期明顯增多。
　　 結論:UbcH10表達能改變大腸癌細胞周期分布,UbcH10過表達大腸癌細胞增殖和侵襲能力增強,而UbcH10基因沉默的大腸癌細胞增殖和侵襲能力受抑制,提示UbcH10基因作為大腸癌治療的靶標是可行的,為大腸癌的基因治療研究提供了新的思路和技術對策。
　　 第四部分

16、UbcH10基因沉默對大腸癌抑制作用的體內(nèi)研究
　　 實驗目的:建立裸鼠皮下大腸癌移植瘤模型,通過RNA干擾沉默移植瘤內(nèi)UbcH10基因的表達,并觀察其對裸鼠移植大腸癌的抑制作用。
　　 實驗方法:
　　 1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pGPU6/GFP/Neo/UbcH10-siRNA(pUbcH10-RNAi)及其對照載體pGPU6/GFP/Neo/siRNA-NC(pRNAi-NC)分別轉(zhuǎn)染大腸癌細胞并通過G4

17、18篩選建立沉默細胞系HT-29/UbcH10-RNAi、HT-29/RNAi-NC以及LoVo/UbcH10-RNAi和LoVo/RNAi-NC。
　　 2.裸鼠皮下注射大腸癌細胞HT-29/UbcH10-RNAi、HT-29/PBS和HT-29/RNAi-NC以及LoVo/UbcH10-RNAi、LoVo/PBS和LoVo/RNAi-NC建立移植瘤模型,觀察腫瘤的發(fā)生和生長狀況,記錄腫瘤的出現(xiàn)時間并繪制腫瘤生長曲線。

18、　　 3.腫瘤細胞接種36天后斷頸處死裸鼠,手術剝離腫瘤拍照并稱取瘤體重量。
　　 實驗結果:
　　 1.Western blot分析證實沉默細胞系HT-29/UbcH10-RNAi和LoVo/UbcH10-RNAi中UbcH10的表達得到有效抑制。
　　 2.裸鼠皮下大腸癌移植瘤模型顯示HT-29/UbcH10-RNAi及LoVo/UbcH10-RNAi組裸鼠的腫瘤生長明顯低于對照組,致死裸鼠時治療組腫瘤的體