超分子免疫磁珠定量PCR技術的建立及大腸癌轉移相關標志物的探討.pdf

1、大腸癌是在環(huán)境和遺傳因素共同作用下，經歷多基因，多步驟、多階段復雜的生物學過程演變而來。大腸癌發(fā)生發(fā)展的經典模式是：結直腸上皮細胞增生—腺瘤—非典型增生—癌—轉移癌。本研究首先應用免疫磁珠捕俘技術和免疫PCR技術以及熒光定量PCR的原理，設計并建立一種新的適合血清微量標志物的檢測方法—超分子免疫磁珠熒光定量PCR技術。然后，用這種技術方法檢測本課題組前期研究中篩選出來的大腸癌轉移相關基因環(huán)氧化酶2基因在大腸癌患者血清中的表達情況，并深入

2、研究環(huán)氧化酶2在大腸癌發(fā)生發(fā)展和轉移中的作用并分析其作為大腸癌轉移標志物的可行性。最后，利用整體成像可視化大腸癌原位移植轉移動物模型及蛋白質組學技術，鑒定大腸癌不同發(fā)病時期血清中的差異表達蛋白，尋找新的大腸癌及轉移相關標志物。實驗方法和結果如下： 第一章建立大腸癌微量血清標志物檢測新技術一超分子免疫磁珠定量PCR技術實驗前選擇大腸癌經典標志物癌胚抗原(CEA)作為理想的大腸癌標志物，采用已知濃度純化癌胚抗原作為實驗標準品，采用羊

3、抗兔IgG標記的DynabeadsM-280SheepAnti-RabbitIgG免疫磁珠作為固相免疫捕俘劑。將生物素標記的DNA片段與等摩爾分子的鏈卵白素和等摩爾分子生物素標記的大腸癌標志物抗體(生物素標記鼠抗CEA抗體)進行交聯結合形成一種超分子復合物，通過PALL-Microsep100k超濾裝置(內含OmegoPES膜)將超分子復合物進行過濾純化，并通過原子力顯微鏡對超分子復合制成超分子復合物后開展技術平臺的構建：先在反應體系內

4、依次加入DynabeadsM-280SheepAnti-RabbitIgG免疫磁珠、兔抗CEA抗體和血清腫瘤標志物癌胚抗原(CEA)，通過免疫磁珠特異性吸附將血清中的標志物捕俘，然后加入超分子復合物，由于該復合物中的生物素化抗體能與捕俘的血清標志物特異結合，其中的模板DNA又能作為免疫熒光PCR的模板進行PCR擴增反應；將反應體系中的復合物經磁力清洗裝置反復清洗，去除未結合的雜物，加入熒光定量PCR反應；將其靈敏性和可靠性與目前使用的雙

5、抗夾心ELISA法進行比較，發(fā)現其敏感性高于目前使用的雙抗夾心ELISA法，使用該技術平臺能檢測出濃度低至1×10-12g/ml(1pg/ml)的癌胚抗原。 第二章環(huán)氧化酶2與大腸癌轉移的關系及其作用機制研究 1.環(huán)氧化酶2(COX2)在大腸癌病人血清和大腸癌細胞系、大腸癌組織的表達 培養(yǎng)不同轉移能力的人大腸癌細胞系SW480和SW620細胞，分別用超分子免疫磁珠定量PCR的方法、組織芯片免疫組織化學、Real-

6、timePCR等方法研究COX2在不同轉移能力人大腸癌細胞系及原發(fā)人大腸癌組織和大腸淋巴結轉移組織以及大腸癌病人血清中的表達。 結果：用超分子免疫磁珠定量PCR檢測平臺檢測。COX2蛋白在SW480和SW620細胞株中均陽性表達；在正常大腸粘膜中不表達，COX2蛋白在淋巴結轉移癌組的異常表達高于原發(fā)大腸癌石蠟組織，兩者相比差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。COX2異常表達與大腸癌發(fā)病相關，并可能與大腸癌淋巴結轉移相關，COX2

7、可以作為大腸癌發(fā)病與轉移的標志物。 2.環(huán)氧化酶2在大腸癌發(fā)病與轉移中的作用研究 采用BLOCK-iTTMU6RNAiEntryVector試劑盒構建干擾COX2基因表達的RNAi慢病毒干擾載體。按說明書操作流程先根據invitrogen公司網上公布的shRNA設計程序(http：//www.invitrogen.com/RNAi)設計3對shRNA，然后將合成shRNA變?yōu)殡p鏈dsoligo，將3對dsoligo轉入p

8、ENTR/U6載體中，將載體轉化oneshottop10chemegallycompetentEcoli菌，挑出抗性克隆，提取穿梭質粒DNA，測序，分析序列完全準確后，用構建的穿梭質粒pENTERTM/U6-shRNA-COX2DNA瞬時轉染SW480-EGFP細胞，挑選出最好的干擾載體pENTERTM/U6-shRNA-3-COX2與慢病毒載體pLenti6/BLOCK-it-DEST進行重組反應，構建穩(wěn)定感染慢病毒干擾載體pLent

9、iU6/COX2ShRNA-3。將慢病毒干擾載體pLentiU6/COX2ShRNA-3轉化OneShotStb13感受態(tài)細胞，提取質粒DNA。獲得穩(wěn)定COX2干擾的SW480-EGFP-COX2i亞克隆細胞株。 進一步考察了環(huán)氧化酶2被干擾后對SW480-EGFP細胞的生物學特性的影響。流式細胞分析結果表明，轉染pLentiU6/COX2ShRNA-3后可以使SW480-EGFP-COX2i細胞的S期細胞比例增加，并出現少量凋

10、亡細胞。MTT法觀察SW480-EGFP-COX2i細胞的增殖能力，結果顯示：和未轉染組SW480-EGFP細胞作為對照，SW480-EGFP-COX2i細胞的增殖速度明顯低于對照組，統(tǒng)計學分析差異有顯著性(P＜0.05)；平板集落形成實驗發(fā)現，SW480-EGFP-COX2i細胞形成的集落數明顯少于對照組(P＜0.05)。細胞運動實驗發(fā)現，穿過matrigel膠的SW480-EGFP-COX2i細胞比對照組細胞數目明顯減少(P＜0.0

11、5)，說明COX2干擾能降低腫瘤細胞的運動能力。 第三章利用可視化動物模型和蛋白質組學技術鑒定大腸癌轉移相關血清標志物 利用陽離子脂質體LipofectamineTM2000將pEGFP-N1質粒轉染人大腸癌SW480細胞，通過G418抗性篩選、亞克隆獲得了G418抗性克隆。該克隆在不施加G418的情況下，SW480細胞中能穩(wěn)定表達EGFP，證明我們已成功地建立了非G418依賴的、穩(wěn)定表達EGFP的人大腸癌細胞株SW48

12、0-EGFP。在腫瘤瘤體明亮熒光的襯托下，借助整體熒光成像系統(tǒng)，我們可以清楚地看到裸鼠移植瘤誘生的宿主新生微血管。移植瘤形成后，我們在無菌環(huán)境下取出移植瘤，將瘤塊剪碎成0.13cm大小的小瘤塊，全麻下于右下腹打開腹腔，暴露腸管，用針頭在回盲部劃痕，造成一小的損傷區(qū)，將瘤塊接種在裸鼠大腸漿膜下肌層，并將瘤塊完全用腸壁包埋，防止暴露于腹腔，然后關閉腹腔，定時在整體熒光成像系統(tǒng)下觀察原位瘤成瘤以及生長轉移情況。結果顯示：SW480-EGFP細

13、胞實體移植瘤塊大腸原位接種后，收集的這些血清標本代表正常情況下、大腸癌發(fā)病荷瘤狀況下和大腸癌發(fā)生轉移狀況下不同階段的血清學變化，為下一步研究提供良好的研究基礎。 建立裸鼠大腸癌原位移植整體成像可視化模型后，收集的10只裸鼠原位接種前、原位接種后第1周、第2周、第4周后的血清，分別將同一時期的血清樣品等量混勻，制成4組血清樣品，按Bio-Rad儀器操作手冊進行二維電泳，電泳后用考馬斯亮藍G-250進行染色。將匹配肽段超過4個，MA

14、SCOT得分大于63分的多肽判定為檢測出的差異蛋白。 結果：將不同時間段血清的2-DE膠結果圖進行比較分析，發(fā)現至少有六個顯著的差異點，經過PDQuest7.1軟件包分析后，發(fā)現六個蛋白質點的表達水平明顯改變，表達水平隨轉移程度的增加而升高。用刀片切取6個差異蛋白質點進行膠內酶解和MALDI-TOF質譜分析，結合數據庫檢索成功鑒定了這些差異蛋白質點為5種蛋白質，它們分別是：結合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)α鏈，載脂蛋白

15、A4(ApolipoproteinA-Ⅳ，APOA4)，載脂蛋白E(ApolipoproteinE，APOE)，免疫球蛋白κ型V區(qū)L鏈(IgkappachainVregion，chainL)和轉鐵蛋白(Transferrin，TRF)。 總之，本課題首先建立了超分子免疫磁珠定量PCR這種適用于檢測血清微量標志物的新的技術方法。該方法具有快速、靈敏的特性。與目前使用的雙抗夾心ELISA方法相比具有靈敏性更高的特點，檢測的濃度范圍達

16、到1×10-12g/ml。隨后我們應用超分子免疫磁珠定量PCR技術檢測檢測COX2在正常人血清和大腸癌病人血清中的表達，發(fā)現COX2在大腸癌患者血清中的陽性率高于正常人，而且轉移性大腸癌患者血清的COX2陽性率高于非轉移癌患者血清；進一步研究發(fā)現COX2基因異常表達與大腸癌發(fā)病和轉移相關，COX2可以作為大腸轉移標志物；通過RNAi技術干擾COX2基因的表達發(fā)現COX2能影響大腸癌細胞的增殖、生長和運動能力，促進血管生成并促進轉移形成。

17、最后，我們又利用大腸癌原位移植可視化轉移模型及蛋白質組學技術，發(fā)現并鑒定了5個與大腸癌轉移相關的血清標志物，即：結合珠蛋白(Haptoglobin，Hp)α鏈，載脂蛋白A4(ApolipoproteinA-Ⅳ，APOA4)，載脂蛋白E(ApolipoproteinE，APOE)，免疫球蛋白κ型V區(qū)L鏈(IgkappachainVregion，chainL)和轉鐵蛋白(Transferrin，TRF)。以上這些研究結果，為今后更深入研究大