人S100C基因表達(dá)載體的構(gòu)建及S100C融合蛋白抗體的制備.pdf

1、S100C是具有EF手型的S100蛋白家族的成員之一。S100蛋白是一組參與細(xì)胞周期活動、細(xì)胞分化、腫瘤生長以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌活動的鈣結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白，在機(jī)體生物學(xué)活動中發(fā)揮著重要的作用。S100C的主要功能是傳導(dǎo)鈣依賴性的細(xì)胞調(diào)節(jié)信號，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和骨架的構(gòu)建。最新研究表明S100C與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系十分密切。本課題組近期運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)S100C蛋白在肺癌組織中表達(dá)異常，提示該蛋白可能在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中有

2、著重要的作用。 本研究采用半定量RT-PCR技術(shù)探討肺癌組織S100C基因的mRNA表達(dá)水平，用PCR的方法獲得S100C基因全序列，并通過設(shè)計合適的酶切位點(diǎn)，構(gòu)建S100C原核表達(dá)載體。對篩選鑒定的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，使之高效表達(dá)融合蛋白，用Ni離子親和層析法純化融合蛋白，通過免疫日本大耳白兔制備抗融合蛋白的多克隆抗體。為下一步大樣本檢測其敏感度和特異度奠定基礎(chǔ)，為鑒定和研究其它潛在腫瘤標(biāo)志物提供理論和技術(shù)支持。

3、 方法： 1．結(jié)合質(zhì)粒載體pET30a(+)的多克隆位點(diǎn)，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行弓物設(shè)計。上游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物引入XhoI酶切位點(diǎn)。 2．以β-actin為內(nèi)參，運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測26例肺癌組織和癌旁組織S100C基因mRNA的表達(dá)水平。運(yùn)用PCR技術(shù)克隆S100C基因的cDNA全長片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽性克隆篩選鑒定。

4、 3．設(shè)立不同誘導(dǎo)組對篩選出的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)時間和IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化。 4．用尿素法溶解包涵體，用Ni離子親和層析法純化融合蛋白。 5．純化后的融合蛋白與弗氏佐劑超聲混合后免疫日本大耳白兔，間隔14d加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。 6．用免疫瓊脂雙向雙擴(kuò)散法檢測抗體效價，Westem blotting檢測抗體特異性。 結(jié)果： 1．肺癌組織中S100C mRNA表達(dá)水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意

5、義(P<0.05)。 2．成功構(gòu)建了S100C原核表達(dá)載體，序列同源性達(dá)100％。 3．以終濃度為0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5h蛋白表達(dá)量最高。通過Ni離子親和層析柱純化融合蛋白，獲得了純度為94.3％的融合蛋白。 4．融合蛋白免疫日本大耳白兔后，產(chǎn)生了高效價高特異性的多克隆抗體。 結(jié)論： 1．High-Affinity Ni-IDA Resin親和層析法是一種高效的純化帶有His-Tag融