BDNF及S100B蛋白在癲癇患兒的表達及其意義.pdf

1、癲癇是兒科常見的神經系統(tǒng)疾病。據(jù)國內多次大樣本調查，我國癲癇的年發(fā)病率約為35/10萬人口，累計患病率約為3.5‰～4.8‰。近年來隨著抗癲癇藥物的不斷發(fā)展，多數(shù)患兒經過正規(guī)用藥能較好地控制發(fā)作，但仍有20％～30％的患兒發(fā)展為難治性癲癇。長期、頻繁或嚴重的發(fā)作給患兒身心健康和其家庭帶來嚴重的影響，而癲癇的發(fā)病機理至今仍然不是十分明確。 關于癲癇的發(fā)病機理目前有多種假說。自1969年Walker首先提出免疫機制可能參與癲癇的發(fā)病

2、機制以來，國內外學者對癲癇的免疫學改變作了大量的研究。目前認為通過免疫學機制發(fā)生癲癇主要有兩種途徑：一是通過局部免疫反應在腦內產生一個具有致癇作用的慢性炎癥病灶；另一種是機體內產生了針對神經元細胞膜的抗體，從而破壞神經元的穩(wěn)定性，產生無明顯病理損害的興奮性癲癇灶。免疫機制最終通過細胞因子網絡而實現(xiàn)。近年來，對細胞因子的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)細胞因子網絡間平衡的改變與神經元的興奮性及神經傳導有著密切的聯(lián)系，一方面與驚厥有關的神經元調亡，反應性

3、膠質細胞增生，軸突再生等過程受細胞因子的調節(jié)；另一方面神經元的興奮性活動及損傷均可改變細胞因子的表達。腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactorBDNF)及EF手型鈣結合蛋白S100B蛋白作為神經系統(tǒng)重要的細胞因子，是目前國內外學者研究的熱點。 BDNF的生理作用非常復雜。有研究表明，BDNF可以保護中樞神經系統(tǒng)對抗代謝性和興奮性氨基酸毒性損傷，防止細胞外Ca2+入胞和細胞內Ca2+釋放，

4、從而維持細胞內Ca2+的水平，穩(wěn)定細胞內環(huán)境；它可以抵抗一氧化氮(NO)介導的谷氨酸細胞毒性，保護神經元免受損傷；可以調節(jié)自由基代謝，增加超氧化物岐化酶和谷光甘肽過氧化物酶等在神經元內的含量，減少自由基積聚，保護神經元免受自由基的攻擊；能促進神經元的生存、分化、發(fā)育以及神經突起生長和分枝，促進神經元損傷后的修復和再生，對神經組織損傷、突觸傳遞和認知功能均有保護作用。 許多證據(jù)證明癲癇病理生理機制與BDNF有關：癲癇模型的大腦中常

5、見局灶性神經細胞死亡，及軸突、樹突、突觸的改變，以及神經細胞的重塑現(xiàn)象，而BDNF是調節(jié)神經細胞生長、形態(tài)、存活及正常死亡的重要因子；神經膠質細胞被認為在神經細胞功能的調節(jié)中起重要作用，而BDNF的受體TrkB是星形膠質細胞起調節(jié)作用的重要環(huán)節(jié)；BDNF能提高興奮性神經突觸傳遞作并減少抑制性神經遞質在激活的突觸中的抑制作用，從而有助于癇樣放電在神經網絡中的傳遞；顳葉癲癇病人的海馬組織的顆粒細胞中，BDNFmRNA的表達明顯增強；伴有谷氨

6、酸釋放和鈣內流的各種對腦的傷害性刺激如腦缺血、驚厥發(fā)作、低血糖昏迷等均可導致海馬和皮質神經元內BDNFmRNA表達顯著增高；BDNF高表達小鼠模型沒有大體的缺陷和行為異常，但表現(xiàn)為紅藻氨酸誘導的驚厥活動增強；剔除BDNF受體TrkB的小鼠模型與正常小鼠相比，重復的電休克下不容易發(fā)展為癲癇。 基于上述實驗結果，我們有理由認為BDNF與癲癇有著密切的關系。BDNF雖然在生理情況下對神經細胞有營養(yǎng)及支持作用，但過度表達的BDNF卻恰好

7、相反，能明顯地增加神經細胞的興奮性，增加驚厥的易感性，從而對神經細胞產生有害的作用。BDNF如同一把雙刃劍，適當?shù)谋磉_對神經系統(tǒng)起營養(yǎng)及保護作用，而過度的表達則表現(xiàn)為對腦神經的興奮毒性。 PanW等研究顯示，靜脈注射BDNF能在血液中維持穩(wěn)定的濃度達60分鐘，并在早期出現(xiàn)快速的向腦擴散，10分鐘后進入腦皮質的BDNF主要分布在腦實質細胞而不是上皮細胞，說明外周血循環(huán)中示經修飾的BDNF能完整地通過血腦屏障，該研究還顯示，腦室內注

8、射BDNF后，BDNF從腦向血液擴散的速率與腦從血液中重吸收BDNF的速率近似[24]。以上的實驗結果為我們測定血漿中的BDNF濃度來評估癲癇患兒大腦的興奮性提供了一定的實驗依據(jù)。 S100B蛋白是一種手形鈣離子傳感器蛋白，也是目前研究比較廣泛的與神經系統(tǒng)有關的細胞因子。它可直接抑制靶蛋白的磷酸化；能激活腦果糖1，6二磷酸醛縮酶和葡萄糖磷酸變位酶，調節(jié)細胞的能量代謝；在鈣離子存在的情況下，能激活一種位于細胞核內的，可以調節(jié)細胞分

9、化和形態(tài)的絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶Ndr；還能作用于光感受器外膜上的鳥苷酸環(huán)化酶，并能通過與微管、微絲等細胞骨架成分直接或間接的相互作用以調節(jié)細胞的形態(tài)；因此，生理條件下，S100B蛋白對神經細胞具有廣泛而重要的生物活性。由于S100B蛋白主要(96％)存在于腦組織中，因而被認為是腦特異性蛋白。 另有研究發(fā)現(xiàn)，Alzheimer病等神經退行性病變病人腦中以及精神分裂癥患者、腦癱患兒血清中均有較高水平S100B蛋白的表達。2004年

10、WainwrightM.S等研究發(fā)現(xiàn)，過度表達S100B蛋白的轉基因小鼠，比野生型及S100B裸基因小鼠更容易受圍產期缺氧損傷，其死亡率及腦神經病理損傷以及由缺氧引起的腦容積丟失均顯著地高于后二者。在體外實驗中S100B還可誘導神經元和神經膠質細胞凋亡。以上證據(jù)說明，腦組織中過度表達的S100B蛋白對神經組織有毒性作用。動物實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后，腦脊液和血清中S100B蛋白含量升高，升高程度與腦損傷程度以及預后有一定的關系，因而

11、S100B蛋白有望成為評估腦損傷程度和判斷疾病預后的新指標。 1.研究目的和內容本研究擬通過測定癲癇患兒以及正常對照兒童血漿中的BDNF及S100B蛋白的濃度，分析比較疾病不同階段、不同發(fā)作類型、不同抽搐持續(xù)時間、治療前后、不同治療效果的癲癇患兒以及正常對照兒童血漿中的BDNF及S100B蛋白的濃度變化，分析BDNF及S100B蛋白在不同癲癇兒童的表達規(guī)律及意義，為進一步深入對癲癇的認識，完善抗癲癇的治療方法提供實驗依據(jù)。

12、 2.材料和方法2.1分組將診斷明確的癲癇患兒按治療與否及治療效果分為三組：未治療組、抗癲癇藥物控制良好組以及抗癲癇藥物控制不佳組，并設正常兒童為對照組。 2.2實驗標本的留取未治療組患兒及控制不佳組患兒均于抽搐后24小時內抽血，控制良好組患兒及正常對照兒童于9AM之前空腹抽血，各抽取枸椽酸抗凝靜脈血2ml。本研究中有7例患兒做了腦脊液檢查，均在抽搐后24小時內腰穿，留末段腦脊液約1.5ml。所抽取標本均立即置高速離心儀離心(

13、1000轉/秒)10分鐘后，留上清液1ml，置一20℃冰箱待測。 2.3實驗方法用ELISA法分別測定三組患兒及正常對照兒童血漿中BDNF及S100B蛋白的濃度，并作統(tǒng)計學分析。試劑盒分別采用美國RayBioteck公司的Human-BDNF-ELISA試劑盒及捷克斯洛伐克BioVendor公司的Human-S100B-ELISA試劑盒。實驗操作過程嚴格按照說明書指示。 2.4統(tǒng)計學方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)

14、據(jù)進行t檢驗、方差分析及相關分析。 3.結果3.1癲癇組患兒血漿BDNF及S100B蛋白濃度均明顯高于正常對照組(p＜0.01)；二者間無顯著相關性(p＞0.05)； 3.2癲癇患兒腦脊液中BDNF及S100B蛋白濃度均明顯高于其血漿中濃度(p＜0.05)，二者呈明顯的正性相關，BDNF相關系數(shù)為0.811(p＜0.05)，S100B相關系數(shù)為0.799(p＜0.05)； 3.3癲癇患兒三個組別間BDNF濃度無顯

15、著差異(p＞0.05)； 3.4控制不佳組患兒血漿中S100B蛋白的濃度明顯低于未治療組患兒(p＜0.01)及控制良好組患兒(p＜0.05)，并與正常對照組無顯著差異(p＞0.05)；未治療組與控制良好組患兒血漿中S100B蛋白的濃度無顯著差異(p＞0.05)； 3.5不同藥物治療的癲癇患兒血漿BDNF及S100B蛋白濃度均無顯著差異(p＞0.05)； 3.6抽搐持續(xù)時間大于5分鐘的患兒血漿BDNF與S100B蛋

16、白濃度均顯著高于抽搐持續(xù)時間小于5分鐘的患兒(BDNF：p＜0.05；S100B：p＜0.01) 3.7控制不佳組血漿BDNF與S100B蛋白濃度之間呈正性相關，相關系數(shù)為0.626，(p＜0.05) 3.8全身性發(fā)作與部分性發(fā)作的癲癇患兒血漿BDNF濃度無顯著性差異(p＞0.05)，但全身性發(fā)作患兒血漿S100B蛋白濃度顯著高于部分性發(fā)作患兒(p＜0.05)。 4.結論4.1BDNF及S100B蛋白主要集中在中

17、樞神經系統(tǒng)表達，并能通過癲癇患兒的血腦屏障到達外周血液。血漿中高水平表達的BDNF可作為神經細胞興奮性升高的指標。血漿中的S100B蛋白可作為評估癲癇患兒腦組織損傷的特異性指標。 4.2癲癇患兒體內均存在過度表達的BDNF，過度表達的BDNF可能參與了癲癇的發(fā)生及發(fā)展過程。不同發(fā)作類型、不同治療時期，不同治效果的癲癇患兒，體內BDNF的表達無顯著差異。 4.3血漿中BDNF濃度越高，大腦神經興奮性越高，抽搐持續(xù)時間越長，